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Muestra de ADN antiguo

El ADN antiguo es ADN que se extrae de especímenes antiguos, como materiales esqueléticos, tejidos momificados u otros especímenes que no se han preservado específicamente para realizar más análisis de ADN.

Es apasionante estudiar el ADN antiguo: ¡nos permite acceder a un punto concreto de la evolución! El ADN se puede extraer de prácticamente cualquier célula. No obstante, este se habrá degradado en cierta medida debido a la exposición a diferentes temperaturas y al agua, entre otros factores. Cuando más antigua sea la muestra de ADN, más probabilidades tiene de haber sufrido más daños. Sin embargo, gracias a los últimos avances en la tecnología de análisis del ADN, hasta el ADN antiguo se puede analizar utilizando la secuenciación de nueva generación. Debido a los daños, el número de ciclos de PCR suele ser limitado. Con cada ciclo, hay riesgo de introducir errores.

Estas son algunas de las características del ADN antiguo: (a) roturas en las cadenas individuales, (b) entrecruzamiento y (c) modificación oxidativa e hidrolítica de bases.

Hay tres paneles. El panel de arriba muestra la estructura química de tres bases de ADN conectadas por grupos fosfato. Se señala la hidrólisis y hay flechas que van de las bases de ADN a imágenes de ellas separadas en componentes químicos más pequeños. Las flechas de estos componentes apuntan a un texto que puede ser “pocas moléculas molde” o “longitud de fragmento corta”. La flecha luego apunta a un texto que dice “contaminación” o “productos de PCR cortos”. El segundo panel muestra la alquilación o reacción de Maillard con una flecha que apunta a “entrecruzamiento en una misma cadena”, que se ve como uniones entre cadenas complementarias de una molécula de ADN. Otra flecha señala a “entrecruzamiento entre moléculas”, que muestra uniones entre una cadena de ADN y otra molécula de ADN u otra proteína. Ambas situaciones resultan en una no amplificación y una contaminación. El tercer panel se llama oxidación e hidrólisis. La flecha de la oxidación señala lesiones de bloqueo en una estructura química que acaba en “jumping PCR” y “secuencias quiméricas”. La flecha que sale de la hidrólisis señala “Lesiones que provocan la incorporación incorrecta de bases”, en las que un átomo de una base se sustituye por otro átomo, creando errores de incorporación de bases y de secuencia.

Figura 1. Algunas características del ADN son las siguientes: (a) roturas en las cadenas individuales, (b) entrecruzamiento y (c) modificación oxidativa e hidrolítica de bases. (Willerslev, E. and Cooper, A., 2005, Proc.R.Soc.B, 272,3–16)

Características del ADN antiguo

Las muestras de ADN antiguo comparten algunas características causadas por los daños sufridos. Al identificar estas características, podemos reconocer una secuencia de ADN antiguo a partir de una secuencia moderna y contaminada (por ejemplo, la muestra de ADN de un individuo que no ha manipulado la muestra adecuadamente antes de analizarla en el laboratorio). A continuación, veremos algunas de las características del ADN antiguo que se tienen en cuenta en un análisis de secuenciación de nueva generación.

  • Daños hidrolíticos

El daño hidrolítico provoca lesiones en la columna vertebral de fosfato, lo que puede acabar en roturas de cadenas individuales o en la pérdida de bases de ADN. La pérdida de purinas (adenina o guanina) se llama depurinación. La hidrólisis puede provocar que la citosina se convierta en uracilo y libere amoníaco en el proceso. A eso se le llama desaminación. Esto también le puede pasar a otras bases (citosina, adenina o guanina).

  • Patrón de sustitución de bases

En las muestras de ADN antiguo se pueden observar patrones comunes de sustitución de bases. Las sustituciones de bases de C > T y G > A están más presentes en las muestras de ADN antiguo que en las de ADN moderno. Sin embargo, estas sustituciones no se distribuyen de igual manera a lo largo de las moléculas de ADN. Las sustituciones C > T se encuentran habitualmente en el extremo 5’ de la molécula de ADN, mientras que las sustituciones G > A se suelen encontrar en el extremo 3’ de la molécula de ADN.

  • Daños oxidativos

Los daños oxidativos ocurren por la interacción del ADN con radiación ionizante o con radicales libres (creados a partir de moléculas de agua por la radiación ionizante), lo que modifica las bases. Algunos daños oxidativos provocan lesiones que bloquean la enzima polimerasa y promueven secuencias quiméricas a través de la «jumping PCR».

  • Entrecruzamiento

El entrecruzamiento puede suceder entre bases de la misma cadena de ADN (entrecruzamiento en una misma cadena), o entre el ADN y otras moléculas (entrecruzamiento entre moléculas). En este último, el ADN puede entrecruzarse con otras cadenas de ADN o con una proteína. El entrecruzamiento puede impedir que se amplifiquen las moléculas molde endógenas, pero también podría estabilizar la molécula de ADN con el tiempo, reduciendo así la fragmentación.

  • Fragmentación

Como ya se ha comentado, el ADN antiguo acumula muchos tipos de daños, incluyendo roturas de cadenas y depurinación, lo que provoca la fragmentación en moléculas de ADN cortas. Como las cadenas de ADN ya están fragmentadas, no debemos exponer la muestra de ADN a más fragmentación en el paso de preparación de la muestra para la secuenciación de nueva generación. Según los últimos estudios, la longitud media de los fragmentos de ADN antiguo varía de 50 a 150 pares de bases.

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