Evaluación de la susceptibilidad microbiana
¿Cómo podemos probar si un organismo puede ser inactivado por un agente antimicrobiano? Al igual que los métodos en los que se emplean múltiples diluciones de un compuesto en una microplaca, hay algunos métodos basados en placa de agar que podemos utilizar para hacernos una idea de lo susceptible que es un microorganismo a un agente concreto.
Ensayo de difusión en disco
En este ensayo, los discos de papel de filtro se tratan con un compuesto antibacteriano de prueba y, a continuación, se colocan en una placa de agar inoculada con bacterias. Están formados por discos que se tratan con un compuesto de control positivo (por lo general, un desinfectante altamente efectivo) y un disco no tratado (por lo general, el control negativo se prueba junto con el compuesto candidato). En este tipo de prueba, el tamaño del área alrededor del disco, donde las bacterias no pueden crecer (denominada «zona de inhibición») nos da un indicio con respecto a la eficacia de los compuestos antimicrobianos.
Experimentos de control
Al estudiar agentes antimicrobianos con placas de crecimiento, es importante que uses controles adecuados para que puedas tener la seguridad de que tus experimentos han funcionado (¡o fallado!). En cualquier caso, los controles te permiten llevar a cabo la mejor interpretación posible de los efectos que observes.
Los controles positivos son aquellos utilizados para demostrar que un experimento es capaz de funcionar. Por ejemplo, en un ensayo de difusión en disco, un control positivo te permitiría saber qué bacteria ha crecido en una placa de agar y qué aspecto tiene la inhibición de crecimiento en dicha placa. ¡Si tu control positivo no sale como era de esperar, puede que tengas que repetir el experimento!
Los controles negativos sirven para comprobar que aquellas cosas que no deberían afectar un experimento no produzcan ningún efecto. Por ejemplo, si diluyes en un reactivo una solución tampón, puedes probar que la solución tampón no tiene efecto en tu experimento.
Figura 1: Un ensayo de difusión en disco. En la imagen anterior, aparece un crecimiento bacteriano en forma de césped marrón solapado. Solo se ha desarrollado una única zona de inhibición alrededor de uno de los discos. En los otros dos discos, aunque parece que hay un ligero impedimento en el crecimiento alrededor de los otros anillos, está tan poco definido que no se puede registrar como una verdadera zona de inhibición.
Disco AMT
Otra forma de ensayo de difusión en disco consiste en el uso de un objeto disponible a nivel comercial. Se trata de un ensayo de disco de multisusceptibilidad a los antibióticos (disco AMT) para comparar muchos antibióticos de forma simultánea. Consta de muchos discos, cada uno de los mismos tratado con un compuesto de prueba distinto. El tamaño de cualquier zona de inhibición que aparezca nos aporta información en lo que respecta a la efectividad de un compuesto antimicrobiano.
Prueba de epsilometría (e-test)
En relación al ensayo de difusión en disco se encuentra la prueba de epsilometría, disponible a nivel comercial. Cada tira de papel está impregnada con una concentración creciente de un candidato antimicrobiano, desde el fondo hasta la parte superior. El ensayo se procesa añadiendo una tira de prueba a una placa de agar en la que se han inoculado bacterias recientemente. Después de un periodo de incubación, la concentración mínima inhibitoria (CMI) de un fármaco necesario para evitar el crecimiento microbiano se determina leyendo la concentración en la tira donde se inhibió por primera vez el crecimiento antimicrobiano.
Figura 2: Un ensayo de disco AMT y una prueba de epsilometría. En ambas placas, el crecimiento bacteriano aparece como un césped marrón. A la izquierda, vemos el disco AMT colocado en una placa de agar. Tres compuestos muestran una posible actividad antimicrobiana debido a la presencia de zonas de inhibición despejadas alrededor de los discos. A la derecha, vemos tres tiras de prueba de epsilometría puestas en la placa de agar. Cada una de ellas muestra una zona de inhibición despejada, con forma de lágrima. El MIC se determina leyendo la concentración presente en la tira, donde se inhibe por primera vez el crecimiento bacteriano (el punto de la zona de inhibición con forma de lágrima).