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Buenas prácticas al realizar una SDS-PAGE

Elección del gel adecuado:

  • Usa un gel con una concentración que permita a las proteínas moverse hacia la parte media o la mitad inferior del gel. Así obtendrás una mejor visualización. Por lo general, las mayores concentraciones de acrilamida son mejores para pesos moleculares más bajos.
  • Usa un gel con una concentración simple para separar proteínas de tamaños similares. Esto hará que se vean más fácilmente, ya que las proteínas se repartirán más uniformemente por el gel.
  • Usa un gel con un gradiente amplio cuando trabajes con muestras desconocidas sin una proteína diana o cuando estés separando proteínas de distintos tamaños. Esto permitirá que se separen proteínas de rangos más extensos.

Una tabla que muestra las concentraciones de acrilamida adecuadas para los geles que tienen como objetivo separar proteínas de tamaños concretos. La columna de la izquierda recoge rangos de tamaños de proteínas medidos en kilo dalton. En la columna de la derecha aparecen las concentraciones de acrilamida en forma de porcentaje. Según la tabla, para separar proteínas de entre 4 y 40 kilo dalton, la concentración adecuada de acrilamida sería de hasta un 20 por ciento. Para proteínas de entre 12 y 45 kilo dalton, la concentración aproximada es del 15 por ciento. Para proteínas de entre 10 y 70 kilo dalton, la concentración aproximada es del 12 coma 5 por ciento. Para separar proteínas de entre 15 y 100 kilo dalton, la concentración debería rondar el 10 por ciento. Para proteínas de entre 50 y 200 kilo dalton, habría que usar una concentración aproximada del 8 por ciento. Para proteínas de más de 500 kilo dalton, la concentración apropiada sería de entre el 4 y el 6 por ciento.

Figura 1. Concentración de acrilamida en geles: Relación entre el tamaño de la proteína y la concentración de acrilamida de los geles.

Preparación de la muestra:

  • Haz que la concentración de proteína y la carga de solución tampón sean uniformes entre todas las muestras para estandarizar la separación.

Carga de la muestra:

  • Coloca la pipeta en el fondo del pocillo sin perforar el gel y libera la muestra lentamente para evitar que se desborde hacia la solución tampón de corrido de los pocillos de alrededor.
  • Añade más glicerol a la muestra si esta se queda flotando. Esto hará que la muestra sea más densa que la solución tampón que la rodea y permitirá que se sumerja hasta el fondo del pocillo.

Corrido del gel:

  • Selecciona una corriente baja para evitar correr el gel demasiado rápido y sobrecalentarlo.
  • Mantén una corriente estable durante el corrido para estandarizar la separación.
  • Deja correr el gel hasta que el frente de tinción haya migrado hasta el extremo inferior del gel sin salir de él.

Tinción del gel:

  • Usa una cantidad generosa de azul de Coomassiekumasi nuevo para teñir el gel.
  • Usa azul de Coomassiekumasi nuevo para cada gel. Así te asegurarás la mejor tinción posible.