Síntesis de ADNc
El ADNc (ADN complementario) es complementario del ARNm y es sintetizado por la enzima transcriptasa inversa (RT) a partir del molde de ARNm. Como está basado en ARNm, el ADNc solo incluye las secciones expresadas de un gen, a diferencia del ADN genómico, que contiene la secuencia genética completa.
A la hora de investigar las regiones del genoma que codifican proteínas, trabajar con ARNm presenta algunos retos. En primer lugar, el ARN se degrada fácilmente debido a las ubicuas ARNasas. Por lo tanto, la transcripción inversa de ARNm a ADNc crea una muestra más estable y fiable para analizar esta sección del genoma, por ejemplo mediante PCR. Además, las técnicas basadas en PCR, como la secuenciación y la PCR cuantitativa, implican el uso de ADN polimerasas, que pueden utilizar el ADNc pero no el ARNm como sustrato.
El partidor utilizado para la síntesis de ADNc a partir de ARNm suele ser un partidor de oligo (dT), que es capaz de unirse a la cola de poliA de las moléculas de ARNm. A veces también se utilizan partidores de hexámeros aleatorios, dependiendo de la secuencia del hexámero, que se unirían aleatoriamente a cualquier ARN de la muestra dependiendo de la secuencia del hexámero. Tras la síntesis del ADNc se forma un híbrido ADN-ARN. Finalmente, el ARN es digerido por la ARNasaH, dando como resultado una molécula de ADNc monocatenario que puede utilizarse directamente en cualquier técnica basada en PCR. Si se requiere un ADNc bicatenario, el ADN monocatenario resultante puede plegarse sobre sí mismo y el extremo 3' se une a una secuencia complementaria en la misma cadena. El ADN bicatenario resultante sirve de partidor para la ADN polimerasa que produce la cadena complementaria.
Al transcribir de forma inversa el ARNm aislado de una muestra de tejido, se transcriben todas las moléculas de ARNm. Por lo tanto, las abundantes copias de ARNm (debido a la alta expresión génica) darán lugar a abundantes copias de ADNc. Del mismo modo, los genes que no se expresan, por lo que se transcriben pocas o ninguna copia de ARNm, no estarán representados en la muestra de ADNc.