Generación de clústeres
Tras completar la preparación de la muestra de NGS, el ADN debe anclarse a la superficie de un chip, donde se amplificará de nuevo y se secuenciará. Esta superficie del chip también se denomina célula de flujo (véase la figura 1). En la superficie de la célula de flujo hay numerosas moléculas cortas de ADN que crean una zona de muy alta densidad.
Hay dos secuencias cortas de ADN unidas a la superficie de la célula de flujo, (aquí en verde y amarillo). Cada una de estas moléculas cortas de ADN es complementaria a una hebra del adaptador previamente añadida a la muestra de ADN, permitiendo así una unión específica en la célula de flujo. Un adaptador se unirá a la molécula verde, mientras que el otro adaptador se unirá a la molécula amarilla.
Figura 1: Célula de flujo que muestra una alta densidad de hebras cortas de ADN adheridas a la superficie.
Pasos de la generación de clústeres
Después de que las moléculas de ADN se unan a la célula de flujo, se producirán dos pasos. Ten en cuenta que la diferente coloración en la figura 1 y en la figura 2 es irrelevante, ya que es simplemente para mostrar que hay dos moléculas cortas de ADN diferentes unidas a la célula de flujo.
1.PCR de puente
La muestra de ADN (en amarillo) unida a la cadena de ADN de acoplamiento (en azul) se doblará y se unirá a una molécula de cadena de ADN de acoplamiento complementaria vecina (en morado), creando un puente (véase la figura 2). Una polimerasa se unirá entonces a la molécula morada y la utilizará como plantilla para crear una copia complementaria. A continuación, el puente se rompe y cada una de las moléculas de ADN se une ahora solo a una molécula corta de ADN. El proceso se repite numerosas veces, generando un clúster, y en este clúster podemos encontrar muestras de ADN que están unidas al ADN de acoplamiento azul y a la secuencia de ADN de acoplamiento morado. En cada clúster se encuentran aproximadamente 4000 moléculas de ADN después de la amplificación por PCR de puente, pero la mitad de ellas se eliminan por lavado, dejando solo 2000 moléculas de ADN por clúster. A continuación se describe este paso.
2.Barrido
En este momento tenemos dos cadenas de ADN complementarias adheridas a la superficie de la célula de flujo, pero solo queremos secuenciar una de ellas (por ejemplo, solo el ADN que está unido a la molécula azul). Haremos un barrido de las otras moléculas de ADN vinculadas a la molécula púrpura, de modo que nos quedarán solamente las moléculas de ADN sintetizadas en la misma orientación. En cada clúster solo encontraremos moléculas de ADN unidas a la molécula azul, y serán idénticas porque las hemos amplificado clonalmente. Al final de la generación de clústeres, tendremos aproximadamente 200 millones de clústeres de ADN amplificados clonalmente en una celda de flujo. ¡Eso es muchísimo ADN listo para ser secuenciado durante el proceso de NGS!
Figura 2: Generación de clústeres mostrando la PCR de puente y la amplificación.