Generación de clústeres

Tras completar la preparación de la muestra para la NGS, el ADN debe anclarse a una superficie de la placa donde se amplificará de nuevo y se secuenciará. Esta superficie de la placa también se denomina célula de flujo y tiene una alta densidad de cadenas cortas de ADN adheridas a su superficie. Las moléculas de ADN son capaces de unirse a un adaptador en la célula de flujo, ya que las secuencias son complementarias.

PASOS DE LA GENERACIÓN DE CLÚSTERES:

Después de que las moléculas de ADN se unan a la célula de flujo hay dos pasos:

PCR de puente

La molécula de ADN que está unida a la molécula corta de ADN (representada como una molécula azul) se doblará y se unirá a la otra molécula (representada como una molécula morada), creando un «puente» (ver Figura 1). Entonces, una polimerasa se unirá a la molécula morada y amplificará el ADN, creando dos moléculas de ADN complementarias entre sí. A continuación, se libera el puente y cada una de las moléculas de ADN se une a una molécula corta de ADN. Este proceso se repite varias veces, lo que da lugar a un clúster en el que se encuentran los dos ADN: las moléculas de ADN que están unidas a la molécula azul y la molécula de ADN que está unida a la molécula morada. Después de la amplificación por PCR de puente hay aproximadamente 4000 moléculas de ADN en cada clúster, pero la mitad de ellas se eliminan por lavado, dejando solo 2000 moléculas de ADN por clúster. A continuación se describe este paso.

Barrido

Aunque en este momento tenemos dos cadenas de ADN complementarias unidas a la superficie de la célula de flujo, solo queremos secuenciar grupos de ADN idénticos (clonales) (por ejemplo, solo el ADN que está unido a la molécula azul). Eliminaremos las otras moléculas de ADN que están unidas a la molécula morada; por lo tanto, ahora solo tendremos moléculas de ADN sintetizadas con la misma orientación. Ahora, en cada clúster, solo encontramos ADN que está unido a la molécula azul, y son idénticos porque se han amplificado clonalmente. Al final del paso de la generación de clústeres, cabe esperar que obtengamos aproximadamente 200 millones de clústeres de ADN amplificados clonalmente en una célula de flujo, ¡lo que es un montón de ADN listo para ser secuenciado!

Figura 1: La generación de clústeres muestra la PCR de puente y la amplificación.