Inhibición competitiva
La ecuación de dobles recíprocos para la inhibición competitiva es la siguiente:
1/V0 = 1/Vmáx + Km • α/Vmáx • 1/[S] en la que α = 1 + I/ KI
Basándonos en esta ecuación, una gráfica de dobles recíprocos debería dar una línea recta, con intersección en 1/ Vmáx y pendiente Km • α / Vmáx. Diferentes gráficas de Lineweaver-Burk con diferentes concentraciones de inhibidor deberían pues crear pendientes distintas (puesto que α aumenta con la concentración de inhibidor), pero con la misma intersección en y. Esto significa que la Vmáx no cambia al haber diferentes concentraciones de un inhibidor competitivo; sin embargo, sí que cambia la Km aparente: Km, Km(ap) (Km(ap) = Km • α). Si las gráficas de dobles recíprocos con 1/V0 en relación con 1/[S] que muestran diferentes concentraciones de inhibidor crean líneas rectas, con pendientes distintas pero con la misma intersección en y, el inhibidor es competitivo (figura 1) [1].
Figura 1: Figura a: Gráfica de Lineweaver-Burk que muestra una inhibición competitiva. Figura b: Pendiente de la regresión lineal con respecto a la concentración de inhibidor.
Cómo calcular KI, Km y Vmáx
Si el inhibidor es competitivo, solo hay que calcular una constante de inhibición. Para calcular la constante de inhibición, hay que llevar a cabo varios ensayos con diferentes concentraciones de inhibidor. Hay que representar en una gráfica todos los conjuntos de datos que se obtengan, y las pendientes y las intersecciones en y pueden determinarse mediante regresión lineal. A partir de estas representaciones, se puede calcular la Vmáx como el recíproco de la intersección en y. Si no se ha determinado ninguno de los parámetros cinéticos, este ajuste lineal no proporcionará suficiente información como para determinar la KI y la Km. Para determinar estos parámetros, hay que representar las pendientes de los diferentes ensayos con respecto a la concentración de inhibidor. Así, nos basaríamos en la siguiente ecuación:
Pendiente competetiva = Km • α/Vmáx = Km/Vmáx + Km/Vmáx • 1/KI • [I]
Esta gráfica debería, por lo tanto, crear una línea recta con intersección Km / Vmáx y una pendiente (Km / Vmáx ) • 1 / KI. Así, la KI puede calcularse dividiendo la intersección en y entre la pendiente. Como la Vmáx ya se ha calculado, la Km se puede calcular a partir de la intersección en y de esta representación, multiplicando dicha intersección por la Vmáx.
Pasos para calcular los parámetros cinéticos al usar un inhibidor competitivo
Prepara gráficas de Lineweaver-Burk con los datos cinéticos y representa los datos usando la regresión lineal (una representación por concentración de inhibidor). Las intersecciones en y de las gráficas de Lineweaver-Burk a diferentes concentraciones de inhibidor deberían ser las mismas (o, al menos, parecidas). Lleva el recíproco a la intersección en y; esta es la Vmáx. Representa las pendientes de cada una de estas líneas como una función de la concentración de inhibidor en una gráfica nueva, y ajusta esta gráfica usando la regresión lineal. Para calcular la Km, multiplica la intersección en y de esta línea por la Vmáx. Para calcular la KI, divide la intersección en y de esta línea entre la pendiente.
Referencias
- Lehninger, Albert L.; Nelson, David L.; Cox, Michael M. (2008). Principles of Biochemistry (5th ed.). New York, NY: W.H. Freeman and Company. ISBN 978-0-7167-7108-1.