Secuenciación del ADN

La secuenciación es una técnica utilizada para «leer» el orden preciso de los nucleótidos de un fragmento de ADN. Se pueden secuenciar pequeños fragmentos de ADN, genes enteros o incluso genomas.

La técnica de secuenciación del ADN más utilizada se basa en la terminación de cadena, desarrollada por Sanger. Este método es muy similar a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), pero solo utiliza un cebador, que se hibrida cerca de la región de interés, en el extremo 3' del ADN molde (Figura 1). Durante la reacción de secuenciación, se añaden una mezcla de nucleótidos normales (dATP, dTTP, dCTP y dGTP) y nucléotidos de «parada» (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP) al ADN molde. Cada uno de los nucleótidos de parada está marcado con un color específico. En cada ciclo, se replica el ADN diana mediante una ADN polimerasa hasta que se añade un nucleótido de parada, que impide que se siga elongando (terminación de cadena). Después de 35 ciclos, se produce un gran número de fragmentos de todas las longitudes posibles. Estos fragmentos se colocan en un gel de acrilamida especializado, donde se detectan sus longitudes y «bases de extremos». Debido a que los fragmentos se separan por tamaños en el gel, los nucleótidos marcados se detectan uno a uno y, por lo tanto, se puede reconstruir la secuencia precisa de ADN en el fragmento.

El objetivo de la secuenciación es, por ejemplo, predecir la secuencia de proteínas de un gen, comparar especies en un nivel de secuencias (genes o genoma) o buscar una mutación.

Figura 1: Resumen esquemático del método de Sanger (terminación de cadena) para la secuenciación del ADN.

Los fragmentos de ADN de todas las longitudes posibles se producen durante los ciclos de elongación, cada uno de los cuales termina con un nucleótido de parada coloreado. Cuando los fragmentos se separan por tamaño en el gel, el orden de los colores detectados indicará la secuencia precisa de ADN.