Parámetros de electroporación

Voltaje

La condición eléctrica para la electroporación de cada microorganismo varía. Por ejemplo, una levadura como Saccharomyces cerevisiae tiene un estado eléctrico óptimo de 40 μL de célula, 1,5 kV durante aproximadamente 5 ms.

Célula

Las células electrocompetentes se utilizan para aumentar la eficacia de la electroporación. Las células de levadura se hacen electrocompetentes mediante el lavado en una solución no iónica para eliminar todas las sales, asegurando que la carga no se trasmita por el medio. La electroporación óptima para la levadura se consigue cuando se utiliza levadura de fase logarítmica media o tardía. La fase logarítmica de la levadura puede dividirse en tres partes:

• Fase logarítmica temprana: el periodo en el que la densidad celular es de aproximadamente 10⁷ células/ml.
• Fase logarítmica media: los cultivos tienen una densidad de entre 1 y 5 × 10⁷ células/ml.
• Fase logarítmica tardía: se produce cuando la densidad celular está entre 5 × 10⁷ y 2 × 10⁸ células/ml.

En la fase logarítmica, la tasa de crecimiento es rápida, y la tasa de división celular supera la tasa de muerte celular. Las células son metabólicamente activas y llevan a cabo una replicación del genoma suficiente para reparar el ADN eficazmente. Por lo tanto, las células en esta fase pueden tolerar un tratamiento agresivo como es la electroporación.

• ADN

La frecuencia de transformación se incrementa con el aumento de la concentración de ADN en el tampón de electroporación. Pero hay que tener en cuenta que una concentración demasiado alta de ADN también puede disminuir la eficacia de la transformación. Hay que determinar la concentración exacta de ADN para cada experimento.

• Medios de electroporación

Para evitar la formación de arcos en la muestra durante la electroporación, es importante lavar bien la célula electrocompetente para eliminar el medio de crecimiento de la célula. El lavado puede realizarse con agua o con una solución no iónica como glucosa, glicerol, sacarosa, sorbitol o polietilenglicol. La presencia de material iónico puede provocar la formación de arcos durante la electroporación.

Preferentemente se utiliza sorbitol, puesto que actúa como un crioprotector no permeable que reduce significativamente el daño de la membrana celular durante la descongelación. Los daños en la membrana reducen en gran medida la eficacia de la transformación.

Durante el procedimiento de electroporación, la temperatura aumenta y las células sufren lesiones de membrana causadas por la rápida entrada y salida de agua, que se debe al gran desequilibrio osmótico extracelular e intracelular. Este tipo de lesión puede evitarse con un estabilizador osmótico como el sorbitol, que actúa como crioprotector y osmoregulador.