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Ensayo de cinética enzimática

La cinética enzimática es el estudio de los mecanismos de las enzimas mediante la determinación de su velocidad de reacción en distintas condiciones. La velocidad de reacción depende de varios factores, entre los que se encuentran la concentración del sustrato y de la enzima, la temperatura, el pH y la presencia de inhibidores. [1]

Arriba, hay una ilustración de la curva de saturación de Michaelis-Mente. En el eje x está la concentración del sustrato y en el eje y está la velocidad de reacción. Una curva de Michaelis-Menten figura en la gráfica como una curva que aumenta rápido y poco después hace meseta. Los datos aparecen marcados como puntos, y hay una línea azul dibujada entre ellos. La gráfica muestra que, a medida que aumenta la concentración de sustrato, aumenta la velocidad de reacción. El aumento de la velocidad de reacción es brusco al principio de la reacción, pero, a medida que aumenta la concentración de sustrato, la velocidad de reacción disminuye y la curva empieza a formar una meseta. En ese punto, la reacción alcanza a su velocidad máxima, que se describe en la gráfica como V máx. ½ • V máx también aparece en la gráfica, donde la reacción ha alcanzado el 50 % de su velocidad máxima. Hay una tercera variable en la gráfica, k m, que es igual a la concentración del sustrato en que la velocidad de reacción es ½ • V máx. Abajo hay otra ilustración de una gráfica; esta tiene el tiempo en el eje x y la formación de producto en el eje y. La curva refleja la reacción enzimática general, que se muestra como el cambio en la concentración a medida que pasa el tiempo. El cambio es el resultado de la formación del producto creado a partir del sustrato. A medida que aumenta el tiempo, también lo hace el producto, de forma lineal, hasta que la curva empieza a formar una meseta como resultado de una velocidad de reacción que va disminuyendo.

Figura 1: Arriba: Curva de saturación de Michaelis-Menten. Abajo: Curva de progreso de una reacción enzimática general.

Cómo realizar un ensayo de cinética

El objetivo de un ensayo de cinética es modelar la velocidad de reacción, V, en función de la concentración de sustrato, [S], como se muestra en la figura 1. Por lo tanto, es necesario medir la velocidad a diferentes concentraciones del sustrato. Para cada concentración del sustrato, se obtiene una curva de progreso que muestra la cantidad de producto formado en función del tiempo. Esta curva de progreso se puede observar en la figura 1. Como se ve en la figura, la velocidad de reacción es aproximadamente constante al principio de la reacción; sin embargo, a medida que el sustrato se va gastando, la velocidad disminuye, y la curva de progreso se convierte en una meseta. Como [S] cambia durante la reacción, es habitual medir las velocidades iniciales (V0) de las reacciones y representarlas con respecto a la concentración del sustrato. La V0 se mide como la pendiente de la curva de progreso al principio de la reacción, cuando la curva de progreso es todavía lineal [1].

El modelo más sencillo de V como una función de [S] es la ecuación de Michaelis-Menten. Las reacciones en las que se puede aplicar la ecuación de Michaelis-Menten muestran un aumento en la velocidad de reacción al aumentar [S]; sin embargo, este aumento se reduce a medida que la velocidad se aproxima a la velocidad máxima, Vmáx, como se ve en la figura 1. En las páginas siguientes, se describirá en más detalle la ecuación de Michaelis-Menten [1].

Factores que influyen en la velocidad de reacción

La temperatura y el pH también tienen un impacto en la velocidad de reacción. Las enzimas tienen un pH óptimo, que depende de la composición de la enzima. Esto se debe a las propiedades de las cadenas laterales de aminoácidos de la enzima: algunas cadenas laterales necesitan protonarse o desprotonarse para crear una enzima funcional. El que una cadena lateral de aminoácidos se protone o se desprotone depende del pKa de la cadena lateral y del pH de la solución. Por ejemplo, la histidina tiene un pKa de 6,0, lo que significa que se protonará casi en su totalidad a pH<6,0 y se desprotonará casi en su totalidad a pH>6,0. Ten en cuenta que el pKa de las cadenas laterales puede alterarse en función del entorno; por eso, el pKa de las cadenas laterales de las enzimas no suele ser el mismo que el de los aminoácidos libres. La temperatura también afecta la velocidad de reacción: un aumento en la temperatura conlleva un aumento en la velocidad de reacción. Sin embargo, a una temperatura concreta, dependiendo de la enzima, la enzima empezará a desnaturalizarse; en consecuencia, la velocidad de reacción empezará a disminuir por encima de esta temperatura [1].

El simulador

En este laboratorio, usarás un simulador para llevar a cabo los experimentos de cinética. Este simulador está basado en un modelo matemático, por lo que es «perfecto», es decir, no provoca errores experimentales. Por supuesto, estos resultados de un ensayo de cinética enzimática no serían así en la vida real, pues es imposible obtener datos tan perfectos.

Referencias

  1. Lehninger, Albert L.; Nelson, David L.; Cox, Michael M. (2008). Principles of Biochemistry (5th ed.). New York, NY: W.H. Freeman and Company. ISBN 978-0-7167-7108-1.

Resumen de la teoría