Espectros de fluorescencia

La fluorescencia se genera cuando los electrones del fluorocromo que han sido llevados a un estado de energía superior descienden de nuevo al estado fundamental (figura 1). Los electrones son llevados al estado de excitación s₂ por luz de una longitud de onda específica. La fluorescencia se emite cuando los electrones pierden el resto de energía al descender del estado s₁ al estado fundamental. La menor energía de la luz emitida supone que esta luz tiene una longitud de onda mayor.

Figura 1: La absorción de luz de una longitud de onda determinada provoca la excitación de los electrones de un fluorocromo al estado s₂. Los electrones pierden parte de la energía, por ejemplo, por causa del calor, y descienden a un estado de energía inferior, que aun así sigue siendo un estado de excitación, denominado s₁. Cuando los electrones descienden de nuevo a su estado fundamental, se emite fluorescencia. La menor energía de la luz emitida supone que esta luz tiene una longitud de onda mayor.

Cuando utilizamos distintos fluorocromos en la misma muestra durante la microscopía de fluorescencia, es importante que los espectros de emisión de los dos fluorocromos no se solapen de manera significativa. Si lo hacen, puede que sea imposible distinguir las señales de las dos moléculas una de otra durante la detección. Esto se conoce como «bleedthrough».