Fragmentación

Una de las limitaciones de la secuenciación de nueva generación es la longitud de la muestra de ADN. La tecnología actual de Illumina puede secuenciar hasta 250 pb. Nuestro genoma es mucho más largo que eso. Por ejemplo, el cromosoma más largo, que es el cromosoma 1, tiene casi 250 millones de pb. Por lo tanto, en la preparación de la muestra de NGS, es necesario fragmentar el ADN o cortarlo en trozos más pequeños. Este paso se conoce como fragmentación.

Las muestras de ADN más cortas, por ejemplo, las muestras de ADN antiguo no tienen que fragmentarse, ya que están parcialmente degradadas en aproximadamente 50 pb. Otro ejemplo es el ADNc generado a partir de miARN (microARN), que también es muy corto.

El ADN se puede fragmentar de dos maneras:

Sonicación:

En la sonicación, el ADN se fragmenta al exponerlo a ondas sonoras (normalmente ultrasonidos). Cuando una onda sonora potente golpea la cadena de ADN, se crean roturas bicatenarias, con lo que se fragmenta la larga cadena de ADN en cadenas de ADN más pequeñas. Para obtener un tamaño específico de ADN, es necesario ajustar la potencia y el tiempo de aplicación de la sonicación.

Fragmentación enzimática:

Las cadenas largas de ADN también pueden fragmentarse mediante reacciones enzimáticas. Existen varias enzimas que son capaces de cortar las cadenas de ADN; pueden dirigirse a secuencias específicas o cortar el ADN de manera aleatoria.