Clonación Gateway

La tecnología Gateway proporciona una vía de clonación rápida y eficiente. Esta tecnología se basa en la utilización de versiones modificadas de las recombinasas del bacteriófago lambda. El virus inserta su genoma en el ADN del huésped usando estas enzimas. El sistema de clonación Gateway las usa para lograr una recombinación altamente eficiente de sitios específicos. La segunda característica útil de este sistema son sus sitios de reconocimiento para las enzimas clonase, denominados sitios att, y el uso de diferentes tipos de vectores.

Observa la siguiente animación para obtener una visión general de la reacción de Gateway.

Reacciones BP y LR

Las reacciones BP y LR son las maneras que tienen los diferentes segmentos de ADN de cambiar de sitio dentro de las construcciones. Durante la reacción BP, se recombinan los sitios attB y attP. Esta reacción intercambia el ADN de las cadenas, lo cual da lugar a un sitio attL y un sitio attR. Durante la reacción LR, los sitios attL y attR se recombinan de forma similar y crean sitios attB y attP. Hay un número limitado de sitios att, que se identifican con números. Esto significa que hay un número limitado de combinaciones. Cada sitio se recombina únicamente dentro de su grupo. Por ejemplo, los sitios attL1 solo se recombinan con los sitios attR1 y dan lugar a sitios attB1 y attP1. La orientación de estos sitios también es específica, y la construcción génica es altamente predecible. La construcción deseada puede obtenerse seleccionando los extremos att, las reacciones y los vectores adecuados.

Tipos de vectores

Los sitios att reciclables son ideales para la creación de bibliotecas de vectores que pueden utilizarse para combinar distintos componentes de circuito de manera eficiente.

• Vector de expresión (AmpR): El clon de expresión es el producto final de una reacción Gateway. Es el plásmido completo, listo para la transformación.

• Vector donante (ccdB, KanR): El vector donante proporciona la cadena a partir de la que se crean los clones de entrada. Los vectores donantes suelen llevar nombres que empiezan por «pDONR». Estos plásmidos tienen sitios attB o attP flanqueando el gen ccdB, además del gen de resistencia a la kanamicina.

• Vector de entrada (KanR): Los vectores de entrada se crean a partir del vector donante y de una secuencia de ADN flanqueada por los sitios att complementarios. Estas secuencias de interés suelen producirse mediante PCR, con cebadores que contienen los sitios att. Los vectores de entrada contienen sitios attL o attR que flanquean la secuencia de interés, además del gen de resistencia a la kanamicina. Los vectores de entrada son ideales para las bibliotecas de componentes de circuito.

• Vector de destino (ccdB, AmpR): El vector de destino proporciona la cadena para crear los clones de expresión. Los vectores de destino suelen llevar nombres que empiezan por pDEST. Estos plásmidos contienen el gen ccdB flanqueado por sitios attL o attR, además de un gen de resistencia a la ampicilina. Los vectores de destino también contienen los orígenes de replicación de huéspedes específicos y patrones de ADN adicionales.

Selección

La selección de los vectores de interés en los diferentes pasos del proceso de clonación Gateway es muy importante. Para la selección, el sistema Gateway se basa en dos resistencias a los antibióticos y en el gen ccdB para realizar una selección positiva. La resistencia a los antibióticos permite a las células transformadas crecer en un medio con antibióticos que matan a las células no transformadas.

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El ccdB codifica una bacteriotoxina que impide la replicación de ADN. Todas las cadenas para los clones Gateway (pDEST y pDONR) llevan este gen, y solo las bacterias con un gen ccdA adicional crecerán cuando las transformen estos plásmidos.