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Resolución de problemas de la tinción de Gram

La tinción de Gram es un proceso delicado que requiere un alto grado de minuciosidad. Cuando el frotis se prepara mal o no se usa la técnica de tinción correctamente, los resultados que se obtienen suelen ser falsos.

Preparación de frotis

  • Frotis bacteriano: si se aplica una capa demasiado gruesa, las bacterias gram negativas parecerán más oscuras y pueden confundirse con las gram positivas.
    Intenta siempre aplicar una sola capa del organismo que quieres estudiar.

  • Fijación: si las bacterias se sobrecalientan durante la fijación, se destruye la pared celular y estas no serán capaces de retener el cristal violeta.
    Como resultado, todas las bacterias resultarán gram negativas.

  • Frotis caducados: si los cultivos son demasiado antiguos, la pared celular bacteriana puede ya estar rota, imposibilitando la retención de la tinción cristal violeta.
    Por tanto, todas las bacterias resultarán gram negativas.

Tinción

Con frecuencia, la decoloración produce resultados falsos en la tinción de Gram.

  • Decoloración insuficiente: si el alcohol (decolorante) se enjuaga antes de que haya tenido efecto en la pared celular, las moléculas de cristal violeta no escaparán a la pared celular gram negativa.
    Como resultado, todas las bacterias se mostrarán gram positivas (moradas) después de aplicar la contratinción de safranina.

  • Exceso de decoloración: si dejas el alcohol (decolorante) en el portaobjetos durante demasiado tiempo, afectará a la pared celular, ya sean bacterias gram positivas o gram negativas.
    Las bacterias gram positivas no pueden retener el cristal violeta y, por tanto, todas parecerán gram negativas (rosa) tras la contratinción con safranina.
    La primera imagen presenta el resultado de una decoloración insuficiente. Dos estructuras con forma de judía, que representan células bacterianas, están coloreadas de morado. Una flecha azul va de cada una de ellas hacia dos secciones transversales de la pared celular, una de las gram positivas, y otra de las gram negativas. A pesar de ser diferentes, en ambas estructuras están presentes moléculas moradas de cristal violeta, además de esferas naranjas que representan el yodo. La segunda imagen presenta el resultado de un exceso de decoloración. Dos estructuras con forma de judía, que representan células bacterianas, están decoloradas. Una flecha azul sale de cada una de ellas hacia dos secciones transversales de la membrana celular interna, una de las gram positivas y otra de las gram negativas. En ambas estructuras, las moléculas moradas de cristal violeta y las moléculas naranjas de yodo flotan sobre la membrana en lugar de estar atrapadas en ella.

Figura A: Decoloración insuficiente.

Figura B: Exceso de decoloración.