Ligación
La ligación es un proceso que une de manera covalente la columna vertebral de fosfato del ADN bicatenario. La lleva a cabo una enzima llamada ADN ligasa. La ADN ligasa, que se suele usar en los laboratorios de biotecnología, se ha aislado a partir del fago T4 o de la E. coli. Ambos catalizan las reacciones de ligación de manera parecida, pero tienen diferentes requisitos de cofactor. La enzima de E. coli necesita NAD+, mientras que la enzima del T4 necesita ATP. Estos cofactores están en la solución tampón.
Reacción de ligación
En general, la ligación se compone de dos pasos:
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Colisión de los extremos de ADN. Esta colisión tiene lugar de manera aleatoria y ocurre menos frecuentemente a bajas temperaturas. Las bajas temperaturas estabilizan el enlace de hidrógeno entre los nucleótidos complementarios. La ADN ligasa alcanza su actividad óptima a 25 o. Por norma general, a menor temperatura de incubación, mayor tiempo de incubación.
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Reacción enzimática. La ADN ligasa cataliza la unión entre el hidroxilo del extremo 3’ y el fosfato del extremo 5’.
Reacción de ligación. El nucleótido de AMP se transfiere al fosfato del extremo 5’. A continuación, el OH del extremo 3’ ataca el enlace AMP-fosfato, formando un enlace covalente a la vez que se libera AMP.
Se puede aumentar la eficacia de una reacción de ligación optimizando la relación inserción:vector. Una relación de 3:1 es un buen parámetro inicial. La concentración del vector de ADN y de la inserción puede medirse con un espectrofotómetro como el NanoDrop. La fórmula necesaria para calcular la cantidad del gen de interés (inserción) que hay que añadir a la reacción de ligación es:
Ejemplo de cálculo de la optimización de la reacción de ligación
Datos
Los resultados de las mediciones del espectrofotómetro son:
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Concentración vector ADN: 30 ng/μl
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Concentración inserción: 15 ng/μl
También tenemos los datos de la longitud del vector y de la inserción, que son 4000 pb y 1000 pb respectivamente. La relación óptima es 3:1. Usaremos 60 ng de vector de ADN.
Cálculos
(vector ng x tamaño inserción kb)/ tamaño del vector kb x inserción/vector = ng de inserción
- (60 ng x 1 kb) / 4 kb x 3/1 = 45 ng of insert
| Componente reacción | Concentración reacción | Volumen | ||
|---|---|---|---|---|
| 10x solución tampón ligación, ADN ligasa T4 | 1X | 20 μl/ 10x = 2μl | ||
| Vector ADN | 60 ng | 60 ng/30 ng/μl= 2 μL inserción | ||
| ADN ligase T4 | 1 unidad | 1 μl | ||
| Total | 20 μl |
Vector plásmido
El vector de expresión contiene múltiples sitios de clonación, un marcador de selección, un origen de replicación, un operador y un promotor fuerte. 
Los plásmidos son moléculas de ADN extracromosómicas que suelen presentar forma de círculos bicatenarios y cerrados covalentemente. Varían en tamaño desde 1 kb hasta más de 200 kb. No todos los plásmidos son vectores. Una molécula de ADN como un plásmido necesita características que le permitan actuar como un vector para la clonación génica. En general, hay dos tipos de vectores en función de su aplicación: vector de clonación y vector de expresión. Ambos tienen las características principales que deben tener los vectores: un gen marcador, un origen de replicación y múltiples sitios de clonación. Sin embargo, los vectores de expresión tienen una característica adicional: son promotores fuertes, pues se usan para expresar proteínas extrañas codificadas en el gen de interés. Los vectores de expresión pueden contener un operador como un regulador de expresión génica. Un operador es un segmento de ADN al que se une un factor de transcripción. Los vectores de clonación se usan principalmente para transportar y multiplicar el gen de interés.
Se usa un marcador de selección para garantizar que el vector huésped retiene ese plásmido concreto. Un origen de replicación le da al plásmido la capacidad de multiplicarse en la célula con independencia del cromosoma principal del huésped.
Ensamblaje de un plásmido
En principio, el ensamblaje de un plásmido requiere los pasos siguientes:
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El plásmido vector circular cerrado y el fragmento del gen de interés se separan mediante una o varias enzimas de restricción.
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El gen de interés se liga al plásmido vector linearizado.
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El plásmido resultante se transforma en un huésped adecuado.
Diferentes enzimas de restricción pueden generar voladizos compatibles. 
Se puede conseguir una mayor tasa de éxito en el ensamblaje de plásmidos al usar fragmentos de ADN con extremos cohesivos/voladizos 5’ o 3’, en comparación con el ensamblaje de plásmidos con fragmentos de ADN de extremos romos. La ADN ligasa une dos fragmentos de ADN con voladizos compatibles. Un fragmento de ADN con un voladizo concreto puede ligarse no solo al fragmento que se ha cortado con la misma enzima de restricción, sino también a cualquier fragmento con extremos compatibles generado por otras enzimas de restricción.
Se puede confirmar el ensamblaje de plásmidos mediante una secuenciación de ADN. Es importante confirmar que la inserción se ha ligado con éxito al vector plásmido, con la conformación correcta y el marco de lectura adecuado. La desviación del marco puede causar mutaciones sin sentido o de falso sentido que conlleven la expresión de una proteína no funcional.