Espectrometría de masas
Principio
Un espectrómetro de masas es una herramienta analítica que mide la masa molecular de una muestra. Las tres partes fundamentales de un espectrómetro de masas son la fuente de ionización, el analizador y el detector. Un espectrómetro de masas realiza lo siguiente:
- Produce iones, a partir de la muestra, en la fuente de ionización.
- Separa estos iones en función de su relación masa-carga en el analizador de masas.
- Fragmenta los iones seleccionados y analiza los fragmentos en un segundo analizador.
- Detecta los iones que surgen del último analizador y miden su abundancia a través del detector que convierte iones en señales eléctricas.
- Procesa las señales del detector, que son transmitidas al ordenador y controla el instrumento a través de la retroalimentación.
MALDI
Hay múltiples métodos de ionización disponibles, sin embargo, los más utilizados son: ionización por electrospray (IE) y desorción/ionización mediante láser asistida por matriz (MALDI). En este laboratorio usamos MALDI.
Hay dos pasos principales presentes en el MALDI, los cuales usan un láser UV para ionizar una muestra. Primero, el péptido a ser analizado es disuelto en una matriz, un disolvente que contiene pequeñas moléculas orgánicas. Estas moléculas tienen una alta absorción en las longitudes de ondas del láser. A continuación, se deja secar la mezcla antes de llevar a cabo el análisis. Esto da lugar a la formación de una matriz cristalina que contiene el péptido de interés. Segundo, la molécula de la matriz es excitada a un estado de mayor energía cuando se encuentra con el láser UV. Esto, finalmente, conduce hacia la formación del ion de interés. La molécula ionizada entra en el analizador de masa y origina el espectro de masa.
TOF
El método de ionización MALDI está acompañado de un analizador de masa llamado tiempo de vuelo (TDV). En el TDV, se mide el tiempo que le lleva a los iones alcanzar el detector. La velocidad es determinada mediante la relación masa-carga (m/z). Los iones más pequeños alcanzarán el detector antes que los más grandes debido a que tienen menos masa. La carga de los iones también determina la velocidad. Los iones con dos o más cargas positivas se moverán más rápido que los iones con solo una carga positiva. Por lo tanto, los iones que sean más pequeños y estén cargados positivamente se moverán más rápido.
El resultado del detector es el espectro de masa, mostrado en un «diagrama de barras». Esta muestra la corriente relativa producida por iones de relación masa/carga variables.
Detección de proteína
Las proteínas son polímeros lineales formados por la combinación de los 20 aminoácidos más comunes, unidos entre sí mediante enlaces peptídicos. La proteína producida por los ribosomas experimenta una modificación covalente denominada modificación postraduccional. Han sido identificadas más de 200 modificaciones.
La detección de rhEPO se ejecuta usando un espectrómetro de masas. La relación masa-carga (m/z) es aproximadamente igual a la masa de proteínas en Dalton. Usamos una muestra de orina para la detección de sustancia. En la mayoría de los casos, es mejor usar como prueba una muestra de orina en vez de sangre para sustancias prohibidas. Esto es debido a que la recogida de orina no es invasiva y produce un gran volumen de muestra, con unas concentraciones de drogas mayores que las presentes en sangre. La orina también tiene menos células y proteínas, lo cual complicaría la extracción.
Diagrama de glucano que consta de bloques de construcción de monosacáridos
Para detectar sustancias prohibidas en orina, primero tenemos que realizar un espectro patrón de orina no contaminada (patrón negativo), así como de las sustancias prohibidas (patrón positivo). Una vez que tengamos estos dos patrones, los podemos comparar con el espectro de la muestra. Si el espectro de la muestra exhibe los mismos picos que hay en el patrón positivo, podemos llegar a la conclusión que la muestra contiene la sustancia prohibida. La espectrometría de masa también puede detectar glucosilación, a medida que los datos del espectrómetro de masas se procesan y se muestran en picos. Por lo general, los picos de glucosilación son marcados con un asterisco o un diagrama de glucanos.
Histograma en el Laboratorio de Labster
Haz clic en el botón azul para elegir los datos de espectrometría de masas de rhEPO expresados en CHO y E.coli. Hay tres gráficas:
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La situada a la izquierda muestra la masa total de la molécula detectada. Los picos en esta gráfica corresponden a la masa molecular de esa proteína en particular.
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La gráfica superior derecha muestra una vista general de la secuencia de péptidos. Los picos en esta gráfica representan un aminoácido en la secuencia peptídica.
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La gráfica inferior derecha muestra la magnificación de la secuencia peptídica que se muestra en la gráfica superior. Los picos en esta gráfica representan un aminoácido en la secuencia peptídica. Hay que tener en cuenta que el diagrama de glucanos señala el sitio donde tiene lugar la glucolisación.