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Mezcla maestra

A continuación, se muestra el número de movimientos de pipeta que se requiere para un experimento con siete tubos de ensayo y cinco reactivos (cuatro de los cuales deben tener la misma concentración). La figura siguiente muestra el número de movimientos de pipeta necesarios sin usar una mezcla maestra. Para el mismo experimento, se usa después una muestra maestra. Fíjate en cómo disminuye el número de movimientos de pipeta; imagina la diferencia en tiempo y en carga de trabajo en experimentos todavía más grandes.

Ilustración que muestra el número total de movimientos de pipeta que se requieren durante un experimento con y sin una mezcla maestra. Se muestran 7 tubos de ensayo vacíos y 5 tubos de ensayo que contienen diferentes reactivos. Los reactivos se muestran con diferentes colores: de izquierda a derecha, los colores de los reactivos son amarillo, rojo, verde y azul. Hay un quinto tubo de ensayo que también contiene un reactivo y que está marcado con color gris. Hay líneas de colores, en las que cada color corresponde a un reactivo, que van de los tubos con reactivos a los tubos de ensayo vacíos, ilustrando así cómo cada reactivo se añade a cada tubo de ensayo. Los reactivos de color amarillo, rojo, verde y azul se añaden todos en la misma concentración. El reactivo gris se añade en diferentes concentraciones en cada uno de los tubos de ensayo vacíos. Cada línea se puede contar como un movimiento de pipeta y el número total de movimientos de pipeta que se requieren para el experimento sin utilizar una mezcla maestra es 35. Debajo de esta imagen tenemos otra ilustración de la misma configuración del experimento, pero en este caso usando una mezcla maestra. Otro tubo de ensayo contiene la mezcla maestra, en azul, que se añade al experimento. Las líneas de colores de los cuatro tubos con reactivos de color amarillo, rojo, verde y azul ahora van de los tubos con reactivos al tubo con la mezcla maestra, lo que resulta en menos movimientos de pipeta. Otras líneas, que también ilustran los movimientos de pipeta, ahora van del tubo con mezcla maestra y el tubo con reactivo gris a los 7 tubos de ensayo vacíos. Todos los movimientos de pipeta de los reactivos a la mezcla maestra y de la mezcla maestra a los tubos vacíos conducen a un número considerablemente menor de movimientos de pipeta: solo 18.

Figura 1: Dos configuraciones de experimento con siete tubos de ensayo y cinco reactivos (cuatro de los cuales deben tener la misma concentración). Esta figura muestra el número de movimientos de pipeta necesarios sin usar una mezcla maestra y usando una mezcla maestra.

Al llevar a cabo un experimento con un número elevado de muestras similares, es habitual preparar una mezcla maestra para disminuir la carga de trabajo en el laboratorio. Si todas tus muestras tienen una mezcla similar de reactivos, en la que solo varía un reactivo de muestra a muestra, puedes preparar una mezcla maestra con todos los reactivos en común (por supuesto, esto solo es posible si los reactivos deben tener la misma concentración). De esta forma, cuando prepares tus muestras, puedes pipetear desde la mezcla maestra y luego añadir el reactivo variable, en lugar de mezclar, por ejemplo, cuatro reactivos diferentes en las cantidades correctas en cada uno de los tubos. Este concepto se ilustra en la figura que está más arriba.

En este caso de cinética enzimática, al tener que usar una concentración de sustrato específica, se puede preparar una mezcla maestra que contenga NAD+, etanol y solución tampón. Cuando se añade la enzima, empieza la reacción, por lo que la enzima no está incluida en la mezcla maestra. En este experimento, no es imprescindible usar una mezcla maestra; no obstante, esta es esencial para muchas aplicaciones y es muy útil en los ensayos de cinética enzimática en general.

Calcular las concentraciones de sustrato

En el experimento, tendrás que calcular cuánto sustrato tienes que añadir en un tubo para obtener la concentración de sustrato deseada. Esto puede hacerse usando la siguiente fórmula:

C1 · V1 = C2 · V2

en la que C = concentración y V = volumen. ¡Recuerda usar las mismas unidades a ambos lados del signo de igual!

Ejemplo: Tenemos una solución de stock del sustrato de 1 M y necesitamos una concentración de 200 mM en un volumen de 500 μl. ¿Qué volumen de solución de stock tenemos que añadir para conseguir la concentración deseada?

Si la concentración de stock es C1, C2 será la concentración final deseada y V2 será el volumen final. Así, el elemento desconocido es V1. Ahora podemos aislar V1, insertar los valores conocidos y calcular el volumen:

Aislamos: V1 = (C2 · V2)/C1

Insertamos y calculamos: V1 = (0,2 M · 0.0005 l)/1 M = 0,0001 l = 100 μl

Resumen de la teoría