Curva de fusión

El análisis de la curva de fusión se emplea para evaluar la especificidad del ensayo con PCR cuantitativa cuando se usan tinciones, como la verde SYBR^®.

El análisis de la curva de fusión es un paso extra al final del proceso de la PCR cuantitativa. Mientras la temperatura de la muestra aumenta poco a poco, el instrumento va midiendo la fluorescencia. A medida que la temperatura asciende, el ADN bicatenario se desnaturaliza y se vuelve monocatenario, lo que hace que la tinción se disocie de él y la fluorescencia disminuya. Así, la variación en la pendiente de esta curva se representa como una función de la temperatura para obtener la curva de fusión. La temperatura de fusión de un amplicón viene dada por la longitud de la secuencia y las bases que la componen. Idealmente, un ensayo específico debería mostrar un solo pico de fusión, que se correspondería con un producto de PCR específico (ver figura 1). El análisis de la curva de fusión nos permite ver si hay algún dímero de cebador en la PCR cuantitativa, como en el caso del pico que hay a la izquierda del pico principal del amplicón en la figura 2. Si se observa un segundo pico tras el principal, como en la figura 2, esto puede indicar que hay una amplificación no específica, es decir, que la secuencia del gen contiene un intrón o que hay otro gen similar de la misma familia genética, por ejemplo.

Figura 1: Curva de fusión ideal.

Figura 2: Curva de fusión con un dímero de cebador y contaminación de un fragmento de ADN más largo.

El análisis de la curva de fusión es una comprobación importante para el análisis de datos de la PCR cuantitativa.