Experimento de secuenciación de nueva generación
Después de la generación de clústeres, podemos comenzar el proceso de secuenciación. Hay varias formas distintas de hacer una secuenciación de nueva generación en función de la plataforma que estés usando. En este laboratorio, utilizamos la secuenciación por síntesis de Illumina. Esto implica que los datos de secuenciación se obtienen al sintetizar cada par de bases. Veamos el proceso en detalle.
Adhesión de la polimerasa
Una vez que el clúster de ADN clonal está unido a la célula de flujo, se le bombean los reactivos de secuenciación. Entran por un lado de la célula de flujo y salen por el otro. La ADN polimerasa T4 se añade y se adhiere a las moléculas cortas de ADN que están unidas a la célula de flujo. La polimerasa T4 está modificada para que solo permita la incorporación de una base.
Los cuatro nucleótidos están marcados con un fluorocromo específico. Como puedes ver en la figura 1, la timina está marcada con un fluorocromo verde, la citosina, con fluorocromo azul, la guanina con fluorocromo rojo y la adenina con fluorocromo naranja. Estos nucleótidos también están modificados: tienen una caperuza 3’ que permite la adición de un solo nucleótido a la vez. Por lo tanto, una vez que se ha añadido un nucleótido al extremo 3' del cebador, no se pueden añadir más nucleótidos. Los nucleótidos restantes que flotan libremente se eliminan del sistema.
Figura 1: Secuenciación por síntesis. Después de que la polimerasa se haya unido al cebador, se añaden nucleótidos marcados con un fluorocromo específico en el extremo 3' del cebador. Los nucleótidos se modifican con una caperuza 3' que permite la adición de un solo nucleótido a la vez. La señal de fluorescencia emitida por el fluorocromo se detecta, y la caperuza 3' se escinde, permitiendo que comience el siguiente ciclo de secuenciación. Nucleótidos marcados con fluorocromo
Detección
Como todos los nucleótidos están marcados individualmente con un fluorocromo específico, podemos identificar los nucleótidos observando la señal de fluorescencia que emiten. Por ejemplo, en la figura 1 podemos ver que un nucleótido marcado con un fluorocromo verde se une al extremo 3' del cebador. Una reacción química desencadena la emisión de luz verde, que puede registrarse tomando una foto. Como sabemos que la timina está marcada con el fluorocromo verde, podemos identificar la base como timina. Al final de cada ciclo se toman cuatro fotos que registran cada uno de los posibles colores. Después de tomar las cuatro fotos, el sistema superpone las cuatro imágenes, de modo que se pueda identificar rápidamente la identidad de la base de cada grupo (ver figura 2).
Figura 2: Imagen superpuesta en la que cada punto coloreado representa un clúster de ADN amplificado clonalmente. Los colores representan los cuatro nucleótidos diferentes: timina, citosina, guanina y adenina.
Corte y eliminación
Una vez tomada la imagen, la caperuza 3' del nucleótido se escinde para que pueda comenzar el siguiente ciclo de secuenciación. La caperuza 3' escindida se retira del sistema. Esto marca el final de un ciclo de secuenciación y el nuevo ciclo puede comenzar con nuevas rondas de nucleótidos y repitiendo los pasos.
Tras la secuenciación, las imágenes se transmiten a un ordenador y, con un programa específico, podemos analizar los datos de secuenciación.