Secuenciación de nueva generación
Secuenciación de nueva generación
La secuenciación de nueva generación es una tecnología de secuenciación avanzada que permite secuenciar muchas moléculas de ADN cortas al mismo tiempo. Esta tecnología también se llama secuenciación paralela masiva. Estas moléculas de ADN cortas se ensamblan comparando su secuencia con una de referencia; de esta forma, se desvela la secuencia de ADN completa (¡que puede ser tan larga como nuestro genoma!).
Existen varias plataformas para la secuenciación de nueva generación, y cada una de ellas utiliza una técnica diferente para lograr la secuenciación del ADN. En este caso, nos centraremos en la tecnología de terminación reversible con tintes empleada por Illumina. En este método, primero se fragmenta el ADN en piezas más pequeñas; luego, se ligan dos moléculas de ADN cortas (llamadas «adaptadores») a cada extremo de la muestra (ver figura 1). Estos adaptadores servirán como los sitios de acoplamiento de los partidores para amplificar el ADN durante la PCR y para unirlo a la celda de flujo. Antes de analizar los datos, hay que quitar los adaptadores porque no son secuencias biológicas.
Primero, las moléculas de ADN con adaptadores y partidores se unen a un cubreobjetos (llamado «célula de flujo») y se amplifican con la enzima polimerasa para crear colonias clonales locales de ADN. Estas colonias de ADN también se conocen como clústeres o grupos de ADN. Cada uno de los clústeres contiene la misma secuencia de ADN; esto explica el nombre de «colonias clonales». Los nucleótidos se etiquetan individualmente con un tinte fluorescente, igual que en la técnica de secuenciación de primera generación. Después de agregar un nucleótido, la elongación se detiene, y se hace una fotografía. A continuación, el bloqueador que se encuentra en la terminal 3' se elimina químicamente del ADN, lo que permite que comience el próximo ciclo de adición de nucleótidos.
Una vez que se extrae el ADN, se debe procesar para prepararlo para la secuenciación. A continuación, se detallan los diferentes pasos para la preparación de la muestra:
A estos pasos los sigue la generación de clústeres y el proceso de secuenciación actual.
Figura 1: Flujo de trabajo de la secuenciación de nueva generación utilizando la plataforma Illumina.
La secuenciación en paralelo produce miles de millones de lecturas por ejecución, lo que es exponencialmente superior a las lecturas proporcionadas por la secuenciación de primera generación. La secuenciación de nueva generación es una técnica bien asentada que puede emplearse para diferentes aplicaciones, como la realización de perfiles SNP, los análisis de expresión génica y la detección de aberraciones genéticas, así como la reorganización de mutaciones o cromosomas.
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