Experimento de secuenciación de nueva generación
Hay muchas plataformas diferentes de secuenciación de nueva generación, y cada una de ellas utiliza una técnica diferente para llevar a cabo la secuenciación del ADN. En este caso, nos centraremos en la tecnología de terminación de tinción reversible empleada por Illumina: secuenciación por síntesis. Esto implica que los datos de secuenciación se obtienen sintetizando cada par de bases.
Después de la generación de clústeres, podemos empezar con el proceso de secuenciación. Vamos a ver el proceso en detalle.
Acoplamiento de la polimerasa
Una vez que hayamos puesto el clúster de ADN clonal en la célula de flujo, se bombean los reactivos en esta. Entran por un lado de la célula de flujo y salen por el otro. Se introduce la ADN T4 polimerasa y se acopla a las moléculas cortas de ADN unidas a la célula de flujo.
Se marcan los cuatro nucleótidos con un fluorocromo específico. En el ejemplo de la figura 1, la timina se marca con un fluorocromo verde, la citosina con un fluorocromo azul, la guanina con un fluorocromo rojo y la adenina con un fluorocromo naranja.
Estos nucleótidos también se modifican: tienen un límite en 3' que solo permite la adición de un nucleótido cada vez. Por lo tanto, después de que un nucleótido se haya añadido al extremo 3' del cebador, no se pueden acoplar más nucleótidos. Cualquier nucleótido que permanezca flotando a la deriva se tiene que sacar del sistema.
Figura 1: Secuenciación por síntesis. Después de que la polimerasa se haya acoplado al cebador, los nucleótidos marcados con un fluorocromo específico se añaden al extremo 3' del cebador. Los nucleótidos se modifican con un límite en 3', que solo permite la adición de un nucleótido cada vez. La señal de fluorescencia emitida por el fluorocromo se detecta, y el límite en 3' se fragmenta, permitiendo que empiece el siguiente ciclo de secuenciación. Nucleótidos marcados con fluorocromo
Detección
Debido a que todos los nucleótidos se marcan de manera individual con un fluorocromo específico, podemos identificar los nucleótidos observando la señal de fluorescencia que emiten. Por ejemplo, en la figura 1, podemos observar que un nucleótido marcado con un fluorocromo verde se ha añadido al extremo 3' del cebador. Una reacción química desencadena la emisión de luz verde, que puede registrarse al capturar una imagen. Como sabemos que la timina está marcada con fluorocromo verde, podemos identificar la base como timina. Al final de cada ciclo, se toman cuatro imágenes, registrando cada uno de los posibles colores. Una vez tomadas las cuatro imágenes, el sistema las superpondrá unas sobre otras. Por lo tanto, podremos identificar fácilmente la identidad de la base de cada clúster (ver figura 2).
Figura 2: Imagen superpuesta, en la que cada punto de color representa un clúster de ADN amplificado de manera clonal. Los códigos de colores se corresponden con los cuatro nucleótidos: timina, citosina, guanina y adenina.
Fragmentación y eliminación
Después de capturar la imagen, se fragmenta el límite 3' del nucleótido para que pueda empezar el siguiente ciclo de secuenciación. Esto marca el fin del ciclo de secuenciación, y el nuevo ciclo puede comenzar mediante la inyección de nucleótidos fluorescentes, nuevamente y repitiendo cada paso.
Después de la secuenciación, las imágenes se importan a un ordenador y los datos de la secuenciación pueden analizarse con un software específico.