Secuenciación del ADN

La secuenciación del ADN es un método para identificar cada una de las bases que conforman la cadena de ADN.

Secuenciación de primera generación

Figura 1: Método de terminación de la cadena. Las moléculas de ADN marcadas son separadas en función de su tamaño. Cada molécula tiene un nucleótido modificado (ddNTP), marcado con un tinte de fluorescencia. El color diferente de fluorescencia indica una base específica.

La secuenciación de primera generación hace referencia al método de terminación de la cadena, desarrollado por Fredrick Sanger y compañeros en 1977 (figura 1). La molécula de ADN se amplifica con un nucleótido modificado, permitiendo solo una adición de base por ciclo. Posteriormente, se amplifica con una longitud variable: Cada par de bases de la cadena es más largo que la molécula anterior. Estas moléculas, a continuación, son separadas en un capilar. Cada base es marcada con un tinte de fluorescencia. Mediante la lectura de las señales de diferentes colores, somos capaces de identificar la base (A,G,T o C).

Secuenciación de nueva generación

La secuenciación de nueva generación es una tecnología de secuenciación avanzada, en donde muchas moléculas cortas de ADN son secuenciadas a la vez. La tecnología también se denomina secuenciación masiva en paralelo. Estas moléculas cortas de ADN, a continuación, se ensamblan, comparando su secuencia con una secuencia de referencia, de este modo, revelando la secuencia completa de ADN, que puede ser muy larga (¡tan larga como nuestro genoma!).

Hay muchas plataformas diferentes de secuenciación de nueva generación y cada una de ellas utiliza una técnica de secuenciación de ADN diferente. En este caso, nos centraremos en la tecnología de terminación de tinte reversible de Illumina. En este método, primero se fragmenta el ADN en cadenas más cortas, y dos moléculas cortas de ADN, llamadas «adaptadores», son ligadas a cada extremo de la muestra (figura 2). Estos adaptadores funcionarán como lugar de acoplamiento de cebadores, para amplificar el ADN durante la PCR y para unirse a la celda de flujo. Antes de analizar los datos, retiraremos estos adaptadores porque no son una secuencia biológica.

Las moléculas de ADN limitadas con adaptadores y cebadores, son puestas primero en un portaobjetos (denominado celda de flujo) y amplificadas con una enzima polimerasa, dando lugar a colonias locales de ADN clonal. Estas colonias de ADN son también conocidas como clústers de genes. Cada clúster contiene exactamente la misma secuencia de ADN; de ahí el término de colonias de ADN clonal. Similar a la técnica de secuenciación de primera generación, los nucleótidos son marcados individualmente con un tinte de fluorescencia. Después de la adición de un nucleótido, la elongación se detiene y se toma una imagen. Seguido a esto, el bloqueador, ubicado en el extremo 3, es eliminado químicamente del ADN, permitiendo seguir con el siguiente ciclo de adición de nucleótidos.

La secuenciación en paralelo produce millones y miles de millones de lecturas por ejecución. Es exponencialmente mayor a las lecturas producidas mediante secuenciación de primera generación. La secuenciación de nueva generación es una potente técnica que puede ser empleada para muchas aplicaciones diferentes, como el perfil SNP, el análisis de la expresión génica y la detección de aberraciones genéticas, como mutaciones o reordenamientos cromosómicos. Una vez que el ADN se extrae, tiene que ser procesado para así ser preparado para la secuenciación.

Los diferentes pasos en la preparación de la muestra están resumidos a continuación:

• Fragmentación
• Reparación de extremo
• Cola A
• Ligación del adaptador
• Amplificación de PCR

A estos les siguen la generación del clúster y el proceso de secuenciación actual.

Mutación del ADN

Hay muchas clasificaciones para las mutaciones del ADN; puedes obtener más información sobre la información de la mutación según la forma en que esté escrita. Por ejemplo:

• 345G>T significa que hay una sustitución del nucleótido, de guanina a timina, en la posición 345.
• 345delGT significa que hay una eliminación de dos nucleótidos (guanina y timina) empezando en la posición 345.
• 345dupA significa que hay una duplicación en la posición 345, dando lugar a dos residuos de adenina.
• 345insTA significa que hay dos nucleótidos insertados (timina y adenina) empezando en la posición 345.