PCR (reacción en cadena de la polimerasa)

La PCR es un método utilizado para preparar miles de millones de copias de secuencias específicas de ADN. A menudo es necesario disponer de un número mayor de copias de la secuencia de ADN específica que el que se encuentra en una muestra típica para analizar el ADN por su secuencia de pares de bases o su longitud. Además, la reacción de PCR es altamente específica, lo que significa que solo producirá copias de una secuencia deseada a partir del ADN molde (muestra). Esta especificidad se ve asegurada por los cebadores, diseñados para ser complementarios e hibridarse en regiones específicas a cada lado de la región de ADN de interés (región objetivo). Estas características hacen que la PCR sea una técnica potente que se utiliza, por ejemplo, en el genotipado de marcadores, antes de la secuenciación, o en diversas pruebas de ADN.

La PCR consta de tres pasos: 1. 1. Desnaturalización, 2. Recalentamiento y 3. Extensión. Extensión. Los pasos se repiten muchas veces (a menudo 30), produciendo miles de millones de copias de ADN de regiones específicas.

Pasos de la PCR

Para preparar miles de millones de copias de ADN, se realizan muchos ciclos repetidos de síntesis de ADN en un tubo de PCR. Cada ciclo incluye tres pasos distintos definidos por la temperatura (Figura 1). Todos los ciclos se realizan sin intervención en una máquina de PCR, que puede cambiar automáticamente la temperatura para crear los pasos.

1. Paso de desnaturalización (95 ºC): A esta alta temperatura, los enlaces de hidrógeno que mantienen unidas las dos cadenas de ADN se rompen, y las cadenas de ADN se separan. El ADN monocatenario está ahora disponible para ser copiado.
2. 2. Paso de hibridación (54 ºC): A 54 ºC, unas fragmentos cortos de ADN, llamados cebadores, se unen a los sitios complementarios del ADN molde. Los cebadores definen la secuencia diana, que es la región específica del ADN que se copiará. La temperatura de hibridación se calcula a partir de la composición de los cebadores (el número de nucleótidos y el número de guanina y citosina). Normalmente, habría que calcular la temperatura de hibridación óptima para cada cebador. En este caso, consideramos 54 °C como la temperatura de hibridación
3. Paso de extensión (72 ºC): A 72 ºC, una enzima llamada ADN polimerasa se encarga de copiar el ADN. Reconoce el extremo 3′ de un cebador unido a una cadena molde y comienza a copiar el ADN molde.

Al final de un ciclo, partes de la cadena de ADN inicial se han duplicado en número. Al final de, por ejemplo, 30 ciclos, que suelen realizarse en la PCR, habrá al menos mil millones (2³⁰) de copias de la secuencia diana en el tubo. Para realizar la PCR, es necesario añadir una polimerasa de ADN termoestable, nucleótidos, cebadores y el ADN que se desea utilizar como molde.

Reactivos para la PCR

• Cebadores: Los cebadores se unirán a una secuencia específica de ADN y marcarán el inicio de la amplificación del ADN.
• Nucleótidos: Los nucleótidos son necesarios para construir la nueva secuencia de ADN.
• Polimerasa: La polimerasa es una enzima que ensambla los nucleótidos en base a la secuencia molde.
• ADN molde: Se requiere un molde para constituir la base de la amplificación de la nueva secuencia de ADN.

Cuando se prepara un experimento de PCR, hay que tener mucho cuidado con las posibles contaminaciones. La PCR es una técnica muy potente para amplificar el ADN. Esto significa que si tienes una pequeña contaminación (por ejemplo, ADN procedente de otra muestra), este ADN también puede ser amplificado, compitiendo con el molde original y destruyendo los resultados de tu experimento. Para evitar la contaminación, hay que utilizar siempre guantes y trabajar en un entorno muy limpio (cambiar las puntas de las pipetas cuando se pipetea de un recipiente diferente, atarse el pelo, no toser ni estornudar alrededor del banco de trabajo de la PCR, y otros).