Amplificación de PCR

PCR (reacción en cadena de la polimerasa)

La PCR es un método utilizado para preparar miles de millones de copias de secuencias de ADN específicas. Suele ser necesaria para obtener una cantidad de copias de la secuencia específica de ADN mayor que la que suele encontrarse en una muestra típica para analizar la secuencia de pares de bases o la longitud del ADN. Además, la reacción PCR es altamente específica, por lo que solo produce copias de la secuencia deseada del ADN molde (la muestra). Esta especificidad la garantizan los cebadores, que están diseñados para ser complementarios e hibridarse con regiones específicas a ambos lados de la región de interés del ADN (región objetivo). Estas características hacen de la PCR una técnica muy potente que puede emplearse, por ejemplo, para genotipificar marcadores antes de la secuenciación o en distintas pruebas de ADN.

Figura 1: La PCR consta de tres pasos: 1. Desnaturalización; 2. Hibridación, y 3. Extensión. Estos pasos se repiten varias veces (normalmente, 30) para producir miles de millones de copias de regiones específicas del ADN.

Pasos de la PCR

Para preparar miles de millones de copias del ADN, se realizan varias repeticiones del ciclo de la síntesis de ADN en el tubo para PCR. Cada ciclo se compone de tres pasos distintos definidos por la temperatura (figura 1). Todos los ciclos se realizan sin intervención humana, dentro de la máquina de PCR, que puede cambiar la temperatura automáticamente tras cada paso.

1. Paso de la desnaturalización (95 ºC): A esta temperatura tan alta, los enlaces de hidrógeno que mantienen unidas las dos cadenas del ADN se rompen y las cadenas se separan. Ahora, las cadenas individuales de ADN están listas para copiarse.
2. Paso de la hibridación (5-10 ºC por debajo del cebador con la Tm más baja): A la temperatura de la hibridación, los fragmentos cortos de ADN llamados «cebadores» se unen a sus sitios complementarios dentro del ADN molde. Los cebadores definen la secuencia objetivo, que es la región específica del ADN que será copiada. La temperatura de hibridación se calcula a partir de la composición (el número de nucleótidos, y también el de guaninas y citosinas) del cebador. Lo normal es que haya que calcular la temperatura ideal de hibridación de cada cebador. En este caso, consideramos que la temperatura de hibridación para todos los cebadores es de 54 °C.
3. Paso de la extensión (72 ºC): A 72 ºC, una enzima llamada ADN-polimerasa se encarga de copiar el ADN. Esta enzima reconoce el extremo 3' de un cebador unido a una cadena molde y comienza a copiar el ADN molde. En este caso, es una polimerasa termoestable porque necesita permanecer activa a la alta temperatura que estamos empleando.

Al final de cada ciclo, las partes de las cadenas iniciales de ADN se han duplicado. Al terminar 30 ciclos, por ejemplo, que son los que se realizan normalmente para las PCR, habrá al menos mil millones (2³⁰) de copias de la secuencia objetivo en el tubo.

Reactivos para PCR

Se necesitan varios reactivos para realizar un experimento de PCR:

• Cebadores: Los cebadores se unen a una secuencia específica de ADN y marcan el inicio de la amplificación del ADN.
• Nucleótidos: Los nucleótidos son necesarios para construir la nueva secuencia de ADN.
• Polimerasa: La polimerasa es una enzima que ensambla los nucleótidos a la base de la secuencia molde.
• ADN molde: Se necesita un molde que sirva como base de la nueva amplificación de la secuencia de ADN.

Cuando estés preparando un experimento PCR, debes tener especial cuidado con la posible contaminación. La PCR es una técnica muy potente para amplificar el ADN. Esto significa que aunque tienes una contaminación muy pequeña (por ejemplo, de ADN de otras muestras), este ADN también puede amplificarse, competir con el molde original y destruir los resultados de tu experimento. Para evitar la contaminación, debes usar guantes en todo momento y trabajar en un entorno muy limpio. Por ejemplo, cambia la boquilla de la pipeta cada vez que vayas a pipetear el contenido de un recipiente distinto, lleva el pelo recogido y no tosas ni estornudes cerca de la mesa de laboratorio para PCR.