Amplificación mediante PCR

Una PCR es un método utilizado para preparar miles de millones de copias de secuencias específicas de ADN.

Por lo general, para analizar la secuencia o la longitud del ADN, se requiere un número mayor de copias de la secuencia de ADN específica que el que se encuentra en una muestra normal. Además, la reacción de una PCR es altamente específica, lo que significa que solo producirá copias de una secuencia deseada a partir del ADN molde (muestra). Los partidores garantizan esta especificidad, puesto que están diseñados para ser complementarios en regiones específicas a cada lado de la región de ADN de interés (región objetivo). Estas características hacen de la PCR una técnica muy útil en procedimientos como la genotipificación de marcadores, antes de la secuenciación, o en diversas pruebas de ADN.

Figura 1. Una PCR consta de tres pasos: 1. Desnaturalización, 2. Alineamiento y 3. Extensión. Los pasos se repiten muchas veces (a menudo 30 veces), lo que da lugar a miles de millones de copias de ADN de regiones específicas.

Pasos de una PCR

Para preparar miles de millones de copias de ADN, se realizan muchos ciclos repetidos de síntesis de ADN en un tubo de PCR. Cada ciclo consta de tres pasos distintos definidos por la temperatura (Figura 1). Todos los ciclos se realizan sin intervención en una máquina de PCR, que puede cambiar la temperatura automáticamente después de cada paso.

1. Desnaturalización (95 ºC): A esta elevada temperatura, los enlaces de hidrógeno que mantienen unidas las dos cadenas de ADN se rompen, lo que provoca que las cadenas de ADN se separen. El ADN monocatenario ya se puede copiar.
2. Alineamiento (54 ºC): A 54 °C, unas partes cortas de ADN llamadas partidores se unen a puntos complementarios del ADN molde. Los partidores definen la secuencia objetivo, que es la región específica del ADN que se copiará. La temperatura de alineamiento se calcula a partir de la composición de los partidores (el número de nucleótidos y el número de guanina y citosina). Normalmente, hay que calcular la temperatura de alineamiento óptima para cada partidor. En este caso, consideramos 54 °C como temperatura de alineamiento para todos los partidores.
3. Extensión (72 ºC): A 72 ºC, una enzima llamada ADN polimerasa se encarga de copiar el ADN. Reconoce el extremo 3′ de un partidor unido a una cadena molde y comienza a copiar el ADN molde.

Al final de un ciclo, algunas partes de las cadenas de ADN iniciales han duplicado su número. Al final de, por ejemplo, 30 ciclos, normalmente realizados mediante PCR, al menos mil millones (2³⁰) de copias de la secuencia objetivo estarán en el tubo. Para realizar la PCR, es necesario añadir ADN polimerasa, nucleótidos, partidores y el ADN que se desea utilizar como molde.

Reactivos de PCR

Se necesitan varios reactivos para realizar un experimento de PCR;

• Partidores: Los partidores se unen a una secuencia específica de ADN y marcan el inicio de la amplificación del ADN.
• Nucleótidos: Se necesitan nucleótidos para construir la nueva secuencia de ADN.
• Polimerasa: La polimerasa es una enzima que ensambla los nucleótidos sobre la base de la secuencia molde.
• ADN molde: Se requiere un molde para que sirva de base de una nueva amplificación de la secuencia de ADN.

Al preparar un experimento de PCR, hay que tener mucho cuidado con la contaminación. Una PCR es una técnica muy potente de amplificación de ADN. Esto significa que si hay una pequeña contaminación (por ejemplo, ADN de otras muestras), este ADN también puede acabar amplificándose, compitiendo con el molde original y arruinando los resultados de tu experimento. Para evitar la contaminación, debes utilizar siempre guantes y trabajar en un entorno muy limpio (cambia las boquillas de las pipetas cuando pipetees de un recipiente diferente, recógete el pelo, no tosas ni estornudes cerca de la mesa de preparación de la PCR, etc.).

Como se ha descrito anteriormente, un error en un experimento de PCR puede sesgar fácilmente el resultado. Por ello, debemos minimizar la probabilidad de error en la PCR, especialmente cuando se enmarca dentro de un proceso tan delicado como la [secuenciación de nueva generación (NGS)] wiki:/Next_Generation_Sequencing-es). Normalmente, el paso de la PCR en la NGS solo consta de 10-12 ciclos. Todo error que se produzca en el paso de la PCR se traducirá en un desajuste en la alineación de los datos de la NGS, especialmente aquellos errores que se produzcan en las primeras rondas de la PCR, que aparecerán en múltiples lecturas y sugerirán una variación genética inexistente en la muestra.