Minipreparación de plásmidos
Hay varios métodos distintos para purificar los ADN plásmidos de las células bacterianas. La minipreparación es un método rápido para aislarlos a pequeña escala que se basa en la lisis alcalina de las células y una posterior purificación del ADN mediante columna de sílice.
Para purificar los plásmidos de un cultivo bacteriano, se deben seguir estos pasos:
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Sedimentar las células centrifugándolas a 10.000 rpm durante 3 min.
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Homogeneizar las células añadiendo solución tampón de homogeneización y pipeteando varias veces.
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Provocar la lisis celular mediante una solución tampón de lisis (que contiene detergente) e invertir el tubo repetidamente.
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Dejar que la lisis de las células se produzca durante un máximo de 5 min a temperatura ambiente.
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Detener la reacción añadiendo una solución tampón de neutralización e invertir el tubo varias veces más. Los grumos blancos que aparecen son la escoria celular.
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Sedimentar la escoria centrifugando durante 10 min a 13.000 rpm. Al final, el plásmido estará en el sobrenadante (la fase líquida).
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Aplicar el sobrenadante a la columna de sílice y centrifugar a 13.000 rpm durante 1 min. El plásmido se unirá al filtro del fondo de la columna. Desechar lo que escurra.
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Lavar el ADN dos veces con una solución tampón de lavado (añadir, centrifugar y desechar).
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Centrifugar durante 1 min sin añadir nada para deshacernos de cualquier resto de soluciones tampón.
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Transferir la columna a un tubo de 1,5 ml limpio y añadir solución tampón de elución (agua con Tris HCl 10 mM). Dejarlo en la mesa de laboratorio durante un par de minutos antes de volver a centrifugar.
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Comprobar la concentración de ADN en el nano-drop.