Vectores de posición

Los vectores de posición son vectores de destino especializados que pueden usarse de manera eficaz para ensamblar mediante la técnica Gibson grandes circuitos biológicos. Cada vector de posición contiene una secuencia aislante de cromatina, un casete de recombinación Gateway y una secuencia de poliadenilación.

Estos motivos de ADN están flanqueados por dos secuencias de nucleótidos únicas (UNS) diferentes de 40 pares de bases. Las UNS están flanqueadas, a su vez, por dos sitios de restricción I-SceI. Esta disposición de motivos de ADN permite que se ensamblen grandes circuitos biológicos de manera rápida y reproducible.

Los vectores de entrada con partes del circuito pueden ensamblarse al vector de posición usando la técnica de clonación Gateway. La digestión SceI del plásmido resultante producirá un fragmento con las partes del circuito y los ya mencionados motivos de ADN, flanqueados por las dos UNS. Estos fragmentos pueden usarse inmediatamente para el ensamblaje de Gibson. Puesto que las UNS son únicas, se garantiza el ensamblaje específico de un gran número de fragmentos diferentes.

Para ensamblar un circuito grande a partir de vectores de posición, hay que llevar a cabo los siguientes pasos:

• Producir vectores de entrada para todas las partes del circuito

• Clonación Gateway de todas las partes del circuito al vector de posición

• Digestión SceI

• Ensamblaje de Gibson de las UNS complementarias