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Reactivos utilizados en la tinción de Gram

En la tinción de Gram se utilizan cuatro reactivos:

1. El cristal violeta (CV) es la tinción primaria y se utiliza para dar un color morado tanto a las bacterias gram positivas como a las negativas.
Las moléculas de CV tienen carga positiva y se unen a estructuras celulares bacterianas de carga negativa.

2. El yodo (I) actúa como fijador químico (mordiente), fijando la tinción morada tanto en las bacterias gram positivas como en las gram negativas.
Las moléculas de yodo se unen a las moléculas de cristal violeta por medio de fuerzas electrostáticas, formando un gran complejo indisoluble de cristal violeta-yodo (complejo CV-I).

3. El alcohol etílico 95 % (etanol) se utiliza para decolorar las bacterias gram negativas. El alcohol disuelve la membrana externa y afecta al peptidoglicano fino, permitiendo que los complejos CV-I morados escapen de la pared celular gram negativa. Las bacterias gram positivas permanecen moradas tras ser lavadas con alcohol, debido a su peptidoglicano grueso y robusto, que resiste al alcohol y retiene los complejos CV-I.

4. La safranina se utiliza como contratinción, tiñendo de rosa las bacterias gram negativas. Como en el caso del cristal violeta, tiene moléculas de carga positiva que se unen a estructuras celulares bacterianas de carga negativa.
Las bacterias gram positivas ya están coloreadas de morado por el cristal violeta, más oscuro, y permanecen así a pesar de añadirse la safranina rosa.

Es importante enjuagar con agua cada uno de los componentes químicos después de cada paso.

Los cuatro estados del experimento de la tinción de Gram. En el primer paso, se vierte el contenido del frasco que tiene sustancia morada, llamada cristal violeta, sobre el portaobjetos de cristal, y se deja así durante 60 segundos. Como consecuencia de ello, las estructuras esféricas y de forma de bastón del interior del círculo, que representan la vista microscópica de las bacterias del portaobjetos de cristal, se colorean de morado. En el segundo paso, se vierte el contenido del frasco que tiene sustancia naranja, llamada yodo, sobre el portaobjetos de cristal, y se deja así durante 60 segundos. Como consecuencia de ello, las bacterias se mantienen moradas si las vemos bajo el microscopio. En el tercer paso, se vierte el contenido del frasco que tiene sustancia azul claro, llamada alcohol etílico 95 %, sobre el portaobjetos de cristal, y se deja así durante 5-10 segundos. Como consecuencia de ello, las bacterias con forma de bastón se decoloran y las esféricas permanecen moradas. En el último paso, se vierte el contenido del frasco que tiene sustancia rosa, llamada safranina, sobre el portaobjetos de cristal, y se deja así durante 45 segundos. Como consecuencia de ello, las bacterias que tienen forma de bastón se colorean de color rosa y las esféricas permanecen moradas. Las bacterias con forma de bastón se denominan gram negativas, y las moradas, gram positivas.