PCR de transcripción inversa

No todos los genes se expresan constantemente en todas las células. Una célula debe transcribir la secuencia de ADN en ARNm para producir la proteína codificada. Por tanto, el nivel de expresión génica corresponde al nivel de ARNm. La expresión génica puede medirse utilizando una reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). La RT-PCR se compone de los siguientes pasos:

Conversión del ARN en ADNc usando transcriptasa inversa
Amplificación del ADNc usando PCR

Figura 1: Pasos para crear ADNc a partir de una plantilla de ARNm. Usando un cebador oligo(dT), el ARNm se transcribe inversamente en ADNc y se hidroliza la hebra de ARN.

El ARNm es más frágil que el ADN y no puede amplificarse por PCR. Por este motivo, el ARNm se convierte en ADN complementario (ADNc). El ADNc es ADN sintetizado a partir de moléculas de ARN mensajero. La síntesis de ADNc la cataliza una enzima llamada transcriptasa inversa, que utiliza al ARN como plantilla para la síntesis del ADN. Originalmente, la transcriptasa inversa se descubrió y aisló en un retrovirus. Estos virus contienen un genoma de ARN; por tanto, los virus necesitan producir una copia ADNc de su genoma para ser compatibles con la maquinaria molecular de la célula receptora.

La reacción RT-PCR se compone de los siguientes pasos:

Se utiliza un fragmento de oligo(T) como cebador para unirlo a la cola de poli(A) del extremo 3' de cada ARNm.
La transcriptasa inversa utiliza el ARNm como plantilla para sintetizar las hebras de ADNc.
El híbrido resultante ARN-ADNc se separa al aumentar la temperatura.
Un cebador específico se hibrida con su secuencia complementaria.
La ADN polimerasa produce la hebra de ADN complementaria, comenzando por el primer sitio de unión.
Las hebras se separan aumentando la temperatura y el ciclo PCR se repite.

Si el gen en cuestión estaba expresado, al final de la reacción RT-PCR habrá miles de millones de copias de dicho gen. La cantidad de copias de ADN puede visualizarse por electroforesis en gel.