Cuantificación del ácido nucleico

Para el análisis de cuantificación se recomienda la espectrofotometría. Esta técnica proporciona información sobre la concentración de ácido nucleico de la muestra junto con dos ratios de calidad, 260/280 y 260/230. Para obtener información sobre la integridad del ARN es necesario aplicar otras técnicas.

La relación 260/280 refleja la pureza del ADN y del ARN. A 260 nm se miden los ácidos nucleicos y a 280 las proteínas. La relación 260/280 recomendada debe estar entre 1,8 y 2,1. Si la relación es inferior, eso podría indicar la presencia de proteínas u otros contaminantes que absorben a 280 nm.

La relación 260/230 se utiliza como una medida secundaria de la pureza del ácido nucleico. A 260 nm se miden los ácidos nucleicos y a 230 se miden las sustancias químicas que quedan en la muestra desde el paso de aislamiento. Los valores de 260/230 deben estar en el intervalo de 2,0-2,2. Si la relación es inferior a la esperada, eso podría indicar la presencia de contaminantes, que absorben a 230 nm (por ejemplo, el fenol).

Medición con espectrofotómetro

La concentración de ácido nucleico puede determinarse midiendo su absorbancia con un espectrofotómetro como el NanoDrop.

La absorbancia se mide a 260 nm (A260), donde los ácidos nucleicos absorben la luz con mayor intensidad. La cantidad de luz absorbida es proporcional a la cantidad de ácidos nucleicos en la muestra.

La relación entre la concentración y la absorbancia se describe mediante la ley de Beer-Lambert: A = c * ε * L, que también se puede escribir como c = A / (ε * L), con

• c : la concentración de ácido nucleico en molar.

• A : la absorbancia en AU.

• ε : el coeficiente de extinción molar dependiente de la longitud de onda (también llamado absorbancia molar) en molar/cm.

• L : la longitud de la trayectoria en cm (para el NanoDrop este valor es 10 mm).

Esta imagen muestra el resultado de una cuantificación espectrofotométrica de ARN de una muestra de ARN de alta calidad.