Preparación de la PCR cuantitativa en tiempo real

Cuando el ARN de la muestra esté extraído y transcrito de manera inversa en ADNc, lo tendrás todo listo para cuantificar las transcripciones usando la PCR cuantitativa en tiempo real.

Las transcripciones solo se pueden cuantificar en relación con un gen de referencia. Los genes de referencia son normalmente genes esenciales para las funciones celulares básicas. Se espera que los genes de referencia se expresen de manera relativamente constante en la mayoría de las células del organismo en condiciones normales y de enfermedad.

Elige un gen de referencia y diseña los pares de cebadores específicos para tu gen objetivo y tu gen de referencia.

Antes de empezar con el experimento de PCR cuantitativa, debes producir mezclas maestras de cada uno de tus pares de cebadores. Usa exactamente la misma concentración de cada uno de los cebadores y añade el reactivo para PCR cuantitativa.

El reactivo para PCR cuantitativa contiene los siguientes elementos:

• Verde SYBR, que muestra su fluorescencia cuando se une al ADN bicatenario.

• ADN-polimerasa para amplificar el ADN.

Mezcla tus muestras de ADNc con cada una de las mezclas maestras e inicia el experimento de PCR cuantitativa.