Proceso de secuenciación

Ahora que tenemos una célula de flujo llena de ADN, todo está listo para empezar el proceso de secuenciación. Hay varias formas de realizar la secuenciación de nueva generación, dependiendo de la plataforma que se utilice. Una de ellas es la secuenciación por síntesis, en la que los datos de secuenciación se obtienen sintetizando todos los pares de bases.

Figura 1: Secuenciación por síntesis. Después de que la polimerasa se haya unido al cebador, se añaden nucleótidos marcados con un fluoróforo específico en el extremo 3' del cebador. Los nucleótidos se modifican con una caperuza 3' que permite la adición de un solo nucleótido a la vez. La señal de fluorescencia emitida por el fluoróforo se detecta, y la caperuza 3' se escinde, permitiendo que comience el siguiente ciclo de secuenciación.

Adhesión de la polimerasa

Una vez que tenemos el grupo de ADN clonal unido a la célula de flujo, los reactivos de secuenciación se bombean a la célula de flujo. Entran por un lado de la célula de flujo y salen por el otro. La ADN polimerasa T4 se une a la molécula corta de ADN unida a la célula de flujo (que actúa como cebador de secuenciación).

Nucleótidos marcados con fluoróforo

Cada uno de los cuatro nucleótidos está marcado con un fluoróforo específico. Por ejemplo, la timina se marca con un fluoróforo verde, la citosina con un fluoróforo azul, la guanina con un fluoróforo rojo y la adenina con un fluoróforo naranja. Estos nucleótidos también se han modificado; tienen una caperuza 3' que solo permite la adición de un nucleótido a la vez. Por lo tanto, una vez que se ha añadido un nucleótido al extremo 3' del cebador, no se pueden añadir más nucleótidos. Los nucleótidos restantes que flotan libremente se eliminan del sistema.

Detección por fluoróforo

Como todos los nucleótidos están marcados individualmente con un fluoróforo específico, podemos identificar los nucleótidos observando la señal de fluorescencia que emiten. Por ejemplo, en la Figura 1 podemos ver que un nucleótido marcado con un fluoróforo verde se une al extremo 3' del cebador. Una reacción química desencadena la emisión de luz verde, que puede registrarse tomando una foto. Como sabemos que la timina está marcada con el fluoróforo verde, podemos identificar la base como timina. Al final de cada ciclo se toman cuatro fotos que registran cada uno de los posibles colores. Después de tomar las cuatro fotos, el sistema superpone las cuatro imágenes de modo que se pueda identificar rápidamente la identidad de la base de cada grupo.

Corte y eliminación

Una vez tomada la imagen, la caperuza 3' del nucleótido se escinde para que pueda comenzar el siguiente ciclo de secuenciación. La caperuza 3' escindida se retira del sistema. Esto marca el final de un ciclo de secuenciación y el nuevo ciclo puede comenzar con nuevas rondas de nucleótidos y repitiendo los pasos.

Para más información: - Secuenciación de extremo único frente a extremos emparejados