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Espectrofotómetro

Un espectrofotómetro es un instrumento que proporciona información sobre la intensidad de la energía irradiada. Un espectrofotómetro es un instrumento que determina la relación entre la intensidad de la luz emitida desde una fuente interna y aquella que atraviesa una solución dada. Esta relación puede emplearse para determinar la concentración de moléculas disueltas en una muestra.

Antes de medir una muestra, el espectrofotómetro se ajusta a una longitud de onda concreta. La longitud de onda detectada se puede ajustar al valor óptimo específico para medir cada compuesto.

Durante la medición, el espectrofotómetro devuelve datos en forma de valores de absorbancia (A). La absorbancia se calcula con esta fórmula: log(I0/It), donde I0 es la intensidad de la luz incidente (la luz que incide en una muestra) e It es la intensidad de la luz que atraviesa la solución y llega al detector fotovoltaico.

La relación entre la absorbancia y la concentración es lineal y viene descrita por la ley de Beer-Lambert:

A = εcl

Donde c es la concentración de la solución; l es el camino óptico, también descrito como la distancia que recorre la luz cuando atraviesa una solución (que normalmente se corresponde con el ancho de una cubeta), y ε es la absortividad, que es específica para cada compuesto.

Ilustración de los componentes de un espectrofotómetro. De izquierda a derecha, una fuente lumínica emite la luz; unas flechas representan la dirección en la que viaja. Estas flechas apuntan hacia la derecha, a un colimador, que se representa como una lente ovalada que la luz atraviesa. Después, las flechas apuntan de nuevo hacia la derecha y la luz atraviesa un monocromador en forma de prisma. Desde el monocromador, la luz se dispersa en un campo más amplio que muestra todas las longitudes de onda, representadas por los distintos colores. La luz alcanza un selector de longitud de onda o una rendija, de manera que solo se deja pasar una longitud de onda concreta representada en este caso como una línea de luz amarilla. La línea amarilla atraviesa una cubeta cilíndrica que contiene la muestra de la solución. A la izquierda de la cubeta está la I 0 y a su derecha, la I t. Al final del espectrofotómetro hay una célula fotoeléctrica o un detector que mide la intensidad de la luz que atraviesa la cubeta. El resultado se muestra en una pantalla digital, también llamada medidor.

Figura 1: Componentes de un espectrofotómetro. La luz emitida por una fuente lumínica atraviesa una rendija, de manera que solo se deja pasar una longitud de onda específica. Parte de esa luz atraviesa la muestra del interior de la cubeta y el detector mide la intensidad al otro lado.

A modo de ejemplo, mediremos las concentraciones de NADH. El NADH tiene su absorbancia máxima a 340 nm; por tanto, el espectrofotómetro se ajusta para medir con esa longitud de onda. La absortividad del NADH, ε = 6220 M-1cm-1. El camino óptico es el ancho de la cubeta, que equivale a 1 cm.

Existen ciertas limitaciones a la ley de Beer-Lambert que deben considerarse al usar un espectrofotómetro. Algunas tienen que ver con problemas técnicos; sin embargo, la ley tiene una limitación real en sí misma, ya que solo es aplicable a soluciones diluidas. A medida que la concentración de una especie absorbente aumenta, también lo hace la frecuencia de las interacciones fisicoquímicas entre sus moléculas. Por tanto, a partir de una concentración dada, las moléculas empiezan a cambiar la distribución de las cargas de las moléculas cercanas. Cuando esto ocurre, la relación entre la absorbancia y la concentración deja de ser lineal. Como norma general, cuando se van a hacer mediciones, lo mejor es quedarse por debajo de un valor de absorbancia 1.

La absorbancia es inversamente proporcional a la transmitancia (la luz que atraviesa una muestra y no es absorbida por ella). Cuando la absorbancia = 1, el 10 % de la luz se transmite a través de la muestra. Cuando es igual a 2, se transmite un 1 % de la luz, y así sucesivamente, según la tendencia logarítmica.