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Principio de la espectrofotometría

El espectrofotómetro se ajusta para medir solo con una longitud de onda concreta, la cual se puede ajustar para que sea la óptima para medir el compuesto con el que estamos trabajando. El espectrofotómetro muestra lo que se llama «absorbancia» (A), que se calcula como log(It/I0), donde I0 es la intensidad de la luz incidente e It es la intensidad de la luz que atraviesa la solución y que mide el espectrofotómetro. Hay una relación lineal entre la absorbancia y la concentración que la Ley de Lambert-Beer describe de la siguiente manera:

A = log (I0 / It) = ε • c • l

Donde c es la concentración de la solución, I es la longitud de la solución (por la que tiene que pasar la luz) y ε es la absortividad, que es específica para cada compuesto. [1]

Un espectrofotómetro está formado por los siguientes componentes (figura 1):

  • una fuente de luz

  • un selector de longitud de onda

  • un recipiente para la muestra (por ejemplo, una cubeta)

  • transductores de radiación

  • un detector

La raya negra recta va desde la fuente de luz, representada como una bombilla, hasta la punta de una pirámide azul, llamada monocromador. Desde ahí, la misma línea recta, ahora llamada I cero, se dobla para ponerse en horizontal y atraviesa una línea vertical negra y gruesa, llamada abertura ajustable. Detrás de la abertura, nos encontramos un rectángulo vertical (la cubeta) con una solución verde (la muestra). La línea I cero atraviesa la cubeta con la muestra, pasa a llamarse I y termina en una estructura elíptica llamada fotorresistencia. Esta fotorresistencia se conecta a otro triángulo, llamado amplificador, que a su vez está conectado a un rectángulo amarillo, en el cual se puede ver el resultado, que equivale a 0,260 A.

Figura 1: La luz que emite la fuente atraviesa la abertura, que solo deja pasar una longitud de onda determinada. Esta luz atravesará la muestra que está en la cubeta; por último, el detector la medirá.

Por ejemplo, vamos a medir las concentraciones de NADH. El NADH registra su absorción máxima a 340 nm; por lo tanto, ajustaremos el espectrofotómetro para que mida dicha longitud de onda. La absortividad del NADH se calcula de la siguiente manera: ε =6220 M-1cm-1. La longitud de la solución se suele ajustar a 1 cm.

La Ley de Lambert-Beer tiene algunas limitaciones que hay que considerar. Algunas están relacionadas con problemas técnicos; sin embargo, su limitación real es que esta ley solo se aplica a soluciones diluidas. Cuando aumenta la concentración de una especie absorbente, también lo hacen las interacciones fisicoquímicas entre las moléculas. Por eso, a partir de una concentración determinada, las moléculas empezarán a cambiar la distribución de cargas de las moléculas vecinas; cuando eso ocurre, la relación entre absorbancia y concentración deja de ser lineal. La regla de oro es que debemos quedarnos debajo de un valor de absorción de 1 al hacer las mediciones.

La absorbancia es inversamente proporcional a lo que se conoce como transmitancia (consulta un libro de texto para ver más detalles). Si tenemos un valor de absorbancia de 1, el 10 % de la luz atraviesa la muestra; si el valor es de 2, solo el 1 % la atraviesa, y así sucesivamente, de forma logarítmica.

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Espectrofotometría