Transformación (técnica biotecnológica)

La transformación es una técnica que se utiliza para insertar ADN exógeno en una célula huésped. Una de las muchas técnicas de transformación celular es la electroporación. Se trata de un método de transformación mecánica en el que se utiliza un pulso eléctrico para crear poros temporales en la membrana celular. Los poros permiten que la molécula de ADN atraviese la membrana celular y entre en la célula. El alto voltaje de la electricidad hace que se formen poros hidrofóbicos en la membrana celular de aproximadamente 2 nm.

Parámetros de la electroporación

• Voltaje

La condición eléctrica para la electroporación de cada microorganismo varía. Por ejemplo, una levadura como Saccharomyces cerevisiae tiene un estado eléctrico óptimo de 40μL de célula, 1,5 kV durante aproximadamente 5 ms.

• Célula

Las células electrocompetentes se utilizan para aumentar la eficacia de la electroporación. Por competencia se entiende la capacidad de una célula para captar ADN extracelular («desnudo») de su entorno. Las células de levadura se hacen electrocompetentes mediante el lavado en una solución no iónica para eliminar todas las sales, asegurando que la carga no sea conducida a través del medio. La electroporación óptima para la levadura se consigue cuando se utiliza levadura de fase logarítmica media o tardía. La fase logarítmica de la levadura puede dividirse en tres partes:

• Fase logarítmica temprana: el periodo en el que la densidad celular es de aproximadamente 10⁷ células/ml.
• Fase logarítmica media: los cultivos tienen una densidad de entre 1 y 5 × 10⁷ células/ml.
• Fase logarítmica tardía: se produce cuando la densidad celular está entre 5 × 10⁷ y 2 × 10⁸ células/ml.

En la fase logarítmica, la tasa de crecimiento es rápida, y la tasa de división celular supera la tasa de muerte celular. Las células son metabólicamente activas y llevan a cabo una replicación del genoma suficiente para reparar el ADN eficazmente. Por lo tanto, las células en esta fase pueden tolerar un tratamiento agresivo como es la electroporación.

• ADN

La frecuencia de transformación se incrementa con el aumento de la concentración de ADN en el tampón de electroporación. Pero hay que tener en cuenta que una concentración de ADN también puede disminuir la eficacia de la transformación. Hay que determinar la concentración exacta de ADN para cada experimento.

• Medios de electroporación

Para evitar la formación de arcos en la muestra durante la electroporación, es importante lavar bien la célula electrocompetente para eliminar el medio de crecimiento de la célula. El lavado puede realizarse con agua o con una solución no iónica como glucosa, glicerol, sacarosa, sorbitol o polietilenglicol. La presencia de material iónico puede provocar la formación de arcos durante la electroporación.

Preferentemente se utiliza sorbitol, puesto que actúa como un crioprotector no permeable que reduce significativamente el daño de la membrana celular durante la descongelación. Los daños en la membrana reducen en gran medida la eficacia de la transformación.

Durante el procedimiento de electroporación, la temperatura aumenta y las células sufren lesiones de membrana causadas por la rápida entrada y salida de agua, que se debe al gran desequilibrio osmótico extracelular e intracelular. Este tipo de lesión puede evitarse con un estabilizador osmótico como el sorbitol, que actúa como crioprotector y osmoregulador.

Esparcimiento

El esparcimiento es un método de distribución uniforme de bacterias en la superficie de una placa de agar. Con un esparcidor de vidrio, se distribuye uniformemente sobre la superficie del agar un pequeño volumen de cultivo microbiano. Procedimiento de esparcimiento:

• Esteriliza un esparcidor de vidrio usando el calor de la llama del mechero Bunsen. En primer lugar, sumerge el esparcidor de vidrio en alcohol (etanol 70 %), desecha el exceso de alcohol y prende el residuo. A continuación, deja que el esparcidor se enfríe.
• Extiende el cultivo microbiano de manera uniforme sobre la superficie de la placa de medios. Aplica la presión uniformemente a medida que el vidrio se extiende a lo largo de la superficie del medio.
• Deja que el cultivo microbiano sea absorbido por la placa de medios.
• Incuba la placa boca abajo para evitar que se formen gotas de agua (condensación) en la placa.

Es importante elegir una sola colonia para aislar clones genéticos puros. Una colonia es un grupo de células que proceden de la misma fuente; por lo tanto, todas las células de una sola colonia contienen idéntica información genética.

Selección de antibióticos

El medio utilizado en la clonación molecular es un medio rico que fomenta el crecimiento microbiano. Se pueden utilizar medios selectivos para evitar la confusión en la selección de colonias transformadas y colonias no transformadas. Un medio selectivo se prepara añadiendo antibióticos como ampicilina, higromicina, derivado de zeocina-bleomicina y kanamicina. El antibiótico utilizado debe coincidir con el gen de resistencia a los antibióticos codificado en un vector plasmídico. Es decir, si un vector plasmídico contiene el gen de la β-lactamasa (gen de resistencia a la ampicilina), se debe utilizar la ampicilina como agente selectivo.

Los microbios transformados presentan el gen de resistencia a los antibióticos codificado en el vector plasmídico. El gen de resistencia a los antibióticos permite seleccionar las colonias transformadas de entre las colonias no transformadas. Como las colonias transformadas expresan ciertas proteínas necesarias para resistir el efecto del antibiótico, pueden sobrevivir en el medio que contiene el antibiótico, a diferencia de las colonias no transformadas.

La eficacia de un determinado sistema de resistencia a los antibióticos viene determinada por:

• El agente selectivo (antibiótico).

Debe inhibir completamente el crecimiento de las bacterias no transformadas.

• El gen de resistencia.

Debe expresar la proteína necesaria para resistir totalmente el efecto del agente selectivo efecto. El nivel de expresión del gen resistente puede ser controlado por señales de control transcripcional y traslacional.

• El material a seleccionar.

El material a seleccionar en este caso son las células microbianas. Las células deben ser susceptibles al efecto del antibiótico.

La ampicilina se usa habitualmente para la selección bacteriana. Sin embargo, la levadura no es susceptible a la ampicilina; por lo tanto, no se puede usar como agente selectivo en el cribado de transformación de levadura. Uno de los varios antibióticos que pueden usarse en el cribado de transformación de levadura es la zeocina. La zeocina forma parte de los antibióticos del tipo bleomicina/phleomicina aislados a partir de Streptomyces. La zeocina provoca la muerte celular al unir y escindir el ADN que hay en interior de la célula. El gen Sh ble gene (gen aislado de Streptoalloteichus hindustanus que codifica la proteína de resistencia a la zeocina). Esta proteína se une a la zeocina de forma estequiométrica causando la inhibición de la actividad de escisión de la cadena de ADN de la zeocina.