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Preparación de muestras para Western blot

Hay distintos métodos para preparar muestras, dependiendo de si la proteína es extracelular o intracelular. Las proteínas intracelulares son más difíciles de extraer y la manera de proceder con ellas ha de diseñarse con cuidado.

Dos muestras de proteína, cada una de ellas representada por una línea azul muy plegada sobre sí misma. La primera es más corta y la segunda, más larga. El calor desnaturaliza la primera. La línea cambia de forma, se despliega un poco. La segunda proteína está unida a sí misma por medio de dos círculos amarillos con una S mayúscula que representan un enlace de disulfuro. A esta proteína la desnaturaliza el beta-mercaptoetanol, que rompe el enlace y también la despliega parcialmente. Bajo ambas proteínas desnaturalizadas aparece una línea en zigzag con una carga negativa en un extremo, una molécula de SDS. El SDS recubre ambas proteínas con una carga negativa uniforme. Al final de la secuencia, ambas proteínas son líneas rectas cubiertas de moléculas de SDS. La molécula más pequeña se mueve por el gel más rápido que la de mayor tamaño.

Figura 1: Preparación de muestras para Western blot.

La composición celular de cada organismo se compone de una compleja muestra de moléculas que incluye proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos y sal. Estas moléculas pueden interferir con el método Western blot, de ahí la importancia de la preparación de muestras. Se puede realizar mediante muchos métodos de disrupción celular. Normalmente, cuando se trata de células de mamíferos, se puede eliminar la membrana celular por lisis por detergente, lisis por congelación/descongelación u homogeneización mecánica y sonicación.

Tras la extracción, la muestra proteica se hierve en una solución que contiene una tinción (azul de bromofenol), un agente reductor del disulfuro (2-mercaptoetanol) y detergente (dodecil sulfato sódico / SDS). La hervir la proteína, esta se desnaturaliza y se despliega. El 2-mercaptoetanol evita que se vuelvan a formar los enlaces de disulfuro e interrumpe así la estructura cuaternaria y terciaria de la proteína, de tal manera que crea cadenas polipeptídicas lineales. El dodecil sulfato sódico confiere a la proteína una carga negativa.

Remitido desde:

Artículo
Western blot
Artículo
Electroforesis en gel de proteínas