Resolución de problemas del Western blot
Burbujas de aire
Provocadas por no haber colocado con cuidado en el gel y la membrana en la pila o por haber eliminado inadecuadamente las burbujas de aire con un rodillo o una tarjeta de plástico. Las burbujas de aire crean un hueco donde no hay solución de tampón y, por tanto, no hay conductividad. La muestra no se transferirá del gel a la membrana en esa zona y la membrana mostrará áreas vacías pequeñas y bien definidas al teñirla con Ponceau S.
Mala conductividad
Puesto que la electricidad la conducen los iones de la solución tampón, si no se ha empapado suficiente, pueden generarse áreas de mala conductividad. Estas áreas tienden a ser más grandes y a estar peor definidas que aquellas causadas por las burbujas de aire.
Sobrecalentamiento
El experimento puede sobrecalentarse si hay un aumento de resistencia debido a una muy mala conductividad o a una falta de enfriamiento. La primera viene causada por un empape insuficiente con solución tampón; la segunda, por no añadir el acumulador de frío durante la transferencia. Esto puede provocar que la membrana se queme o el gel se derrita. En las áreas donde se haya derretido el gel, la transferencia de proteínas no ocurrirá y cuando se tiña la membrana con Ponceau S, parecerán vacías.
Dirección de migración errónea
Las proteínas migran del cátodo al ánodo. Por tanto, el gel debe mirar hacia el ánodo y la membrana hacia el cátodo. Si la pila está ensamblada de manera incorrecta o el casete se inserta al revés en el tanque, las proteínas podrían transferirse en la dirección del papel de filtro en vez de hacia la membrana. Al teñirla con Ponceau S, la membrana aparecerá vacía.
Capas no alineadas
Si no se alinean bien las capas o no se han compactado lo suficiente, puede que se muevan durante el experimento. Esto provocará unas bandas menos definidas en la membrana al teñirla con Ponceau S.
Orientación incorrecta
Las proteínas se cargan en el gel SDS-PAGE en un orden determinado. Si se gira o se voltea el gel durante el paso de transferencia, puede que se mezclen las muestras. Para evitarlo, el gel no debería tener un aspecto simétrico. Esto puede conseguirse cortando una esquina. También puede resultar útil marcar la membrana con un bolígrafo.