Spettri di fluorescenza

La fluorescenza è generata quando gli elettroni nel fluoroforo, che sono stati portati ad uno stato di energia superiore, ricadono nello stato fondamentale (Figura 1). Gli elettroni sono portati allo stato eccitato S₂ dalla luce di una specifica lunghezza d'onda. Perdono poi parte di questa energia, per esempio attraverso il calore, e tornano nello stato eccitato S₁. La fluorescenza viene emessa quando gli elettroni perdono l'energia rimanente mentre ricadono da s₁ allo stato fondamentale. La minore energia della luce emessa significa che questa luce ha una lunghezza d'onda più elevata.

Figura 1: l'assorbimento della luce di una specifica lunghezza d'onda causa l'eccitazione degli elettroni in un fluoroforo nello stato eccitato S₂. Gli elettroni perdono parte dell'energia, per esempio attraverso la perdita di calore, e ricadono in uno stato di energia inferiore, ma ancora eccitato, chiamato S₁. Quando gli elettroni scendono nello stato fondamentale, viene emessa la fluorescenza. La minore energia della luce emessa significa che ha una lunghezza d'onda più lunga.

Quando si usano fluorofori diversi nello stesso campione nella microscopia a fluorescenza, è importante che gli spettri di emissione dei due fluorofori non si sovrappongano significativamente. Se lo fanno, può essere impossibile distinguere il segnale delle due molecole l'uno dall'altro durante la fase di rilevamento. Questo fenomeno è noto come bleedthrough.