L'assemblage 3A

La méthode d'assemblage 3A (trois antibiotiques) permet d'assembler deux bio-briques à l'aide d'un clonage par enzymes de restriction. Trois résistances aux antibiotiques différentes permettent une sélection efficace des bons assemblages grâce aux antibiotiques. L'assemblage 3A utilise les sites de restriction sur le préfixe et le suffixe pour assembler les deux parties.

Une sélection antibiotique efficace évite d'avoir recours à la purification sur gel et à la PCR des colonies obtenues. En théorie, environ 97 % des colonies devraient correspondre à l'assemblage souhaité.

Méthode

Pour un assemblage réussi, il faut deux parties et un squelette avec différents gènes de résistance aux antibiotiques (symbolisés par des flèches jaunes dans la figure 1).

Figure 1 : assemblage 3A (source : iGEM.org)

• Digestions par enzymes de restriction

  • L'échantillon de gauche est découpé avec EcoRI (E) et SpeI (S).

  • L'échantillon de droite est découpé avec XbaI (X) et PstI (P).

  • Le squelette plasmidique est découpé avec EcoRI (E) et PstI (P). Dans l'exemple de la figure 1, un squelette plasmidique linéarisé est utilisé. On peut aussi utiliser un plasmide contenant un gène ccdB.

• Les trois digestions par enzymes de restriction sont chauffées pour détruire toutes les enzymes de restriction.

• Ligature : une quantité équimolaire des trois produits de digestion par enzymes de restriction est combinée dans une réaction de ligature. Le résultat souhaité est la ligature de l'extrémité sortante SpeI de l'échantillon de gauche avec l'extrémité sortante XbaI de l'échantillon de droite, ce qui donne une cicatrice qu'aucune de nos enzymes ne peut découper. Le nouvel échantillon composite est ligaturé au squelette plasmidique de construction sur les sites EcoRI et PstI.

• Lorsque la ligature est transformée en cellules et cultivée sur des plaques avec l'antibiotique C, seules les colonies dotées de la bonne construction survivent.