La transcription inverse
L'ADNc (ADN complémentaire) est complémentaire de l'ARNm et est synthétisé par l'enzyme transcriptase inverse (TI) à partir de la matrice d'ARNm. Parce qu'il est basé sur l'ARNm, l'ADNc ne comprend que les sections exprimées d'un gène, alors que l'ADN génomique contient la séquence entière du gène.
Lorsqu'on étudie les régions du génome codant pour les protéines, travailler avec l'ARNm présente certains défis. Le plus important est que l'ARN est facilement dégradé par les RNases omniprésentes. Par conséquent, la transcription inverse de l'ARNm en ADNc crée un échantillon plus stable et plus fiable pour analyser cette section du génome, par exemple par PCR. Plus important encore, les techniques basées sur la PCR comme le séquençage et la qPCR impliquent l'utilisation d'ADN polymérases, qui peuvent utiliser l'ADNc mais pas l'ARNm comme substrat.
L'amorce utilisée pour la synthèse d'ADNc à partir d'ARNm est généralement une amorce oligo(dT), qui est capable de s'hybrider à la queue polyA des molécules d'ARNm. Des amorces hexamères aléatoires sont également parfois utilisées, en fonction de la séquence de l'hexamère, qui se lierait de manière aléatoire à tout ARN de l'échantillon selon la séquence de l'hexamère. Après la synthèse de l'ADNc, un hybride ADN-ARN est formé. Enfin, l'ARN est digéré par la RNaseH, ce qui donne une molécule d'ADNc simple brin qui peut être utilisée directement dans toute technique basée sur la PCR. Si un ADNc double brin est nécessaire, l'ADN simple brin résultant peut se replier sur lui-même et l'extrémité 3' se lie à une séquence complémentaire sur le même brin. L'ADN double brin résultant sert d'amorce à l'ADN polymérase qui produit le brin complémentaire.
Lors de la transcription inverse de l'ARNm isolé d'un échantillon de tissu, toutes les molécules d'ARNm sont transcrites. Par conséquent, des copies très abondantes d'ARNm (dues à une forte expression du gène) conduiront à des copies très abondantes d'ADNc. De même, les gènes qui ne sont pas exprimés, et dont les copies d'ARNm sont peu ou pas transcrites, ne seront pas représentés dans l'échantillon d'ADNc.