La génération de cluster
Après la préparation de l'échantillon NGS, l'ADN doit être ancré sur la surface d'une puce, où il sera à nouveau amplifié et séquencé. La surface de cette puce est également appelée lame de verre (voir la figure 1 ci-dessous). De nombreuses molécules d'ADN courtes sont fixées à la surface de la lame de verre, créant ainsi une zone à très haute densité.
Deux courtes séquences d'ADN sont fixées à la surface de la lame de verre (ici en vert et en jaune). Chacune de ces courtes molécules d'ADN est complémentaire à un brin de l'adaptateur qui a été ajouté à l'échantillon d'ADN, permettant ainsi une liaison spécifique sur la lame de verre. Un adaptateur se liera à la molécule verte, tandis que l'autre adaptateur se liera à la molécule jaune.
Figure 1 :
Les étapes de la génération des clusters
Une fois que les molécules d'ADN sont liées à la lame de verre, deux étapes vont se produire. Notez que la différence de couleur entre la figure 1 et la figure 2 n'a pas d'importance, car elle sert simplement à montrer que deux molécules d'ADN courtes différentes sont fixées à la lame de verre.
1. La PCR "en pont"
L'échantillon d'ADN (en jaune) lié au brin d'ADN d'accueil (en bleu) va se plier et se lier à une molécule de brin d'ADN d'accueil complémentaire voisine (en violet), créant ainsi un "pont" (voir figure 2). Une polymérase va alors se fixer à la molécule violette et l'utiliser comme modèle pour créer une copie complémentaire. Le pont est alors rompu, et chacune des molécules d'ADN n'est plus liée qu'à une courte molécule d'ADN. Le processus est répété de nombreuses fois, générant un amas (cluster), et dans celui-ci nous pouvons trouver des échantillons d'ADN qui sont liés à l'ADN d'amarrage bleu et liés à la séquence d'ADN d'amarrage violet. Environ 4 000 molécules d'ADN sont trouvées dans chaque cluster après l'amplification PCR en pont, mais la moitié d'entre elles sont éliminées par lavage, ne laissant que 2 000 molécules d'ADN par cluster.
Figure 2 : La génération de clusters montrant l'amplification et la PCR en pont.
2. L'élimination
Pour le moment, nous avons deux brins d'ADN complémentaires liés à la surface de la lame de verre. Mais nous voulons seulement séquencer l'un d'entre eux (par exemple, seulement l'ADN qui est lié à la séquence d'ADN d'amarrage bleue). Nous allons éliminer les autres molécules d'ADN qui sont liées à la molécule violette ; nous allons donc continuer avec les molécules d'ADN qui ont été synthétisées avec la même orientation. Dans chaque cluster, nous trouvons uniquement de l'ADN qui est lié à la molécule bleue, et ils sont identiques, car ils ont été amplifiés de manière clonale. À la fin de l'étape de génération des clusters, on peut s'attendre à avoir environ 200 millions d'ADN amplifiés de façon clonale sur une lame de verre. Cela laisse beaucoup d'ADN à séquencer au cours du processus NGS.