La génération d'amas

Une fois l'échantillon SNG préparé, l'ADN doit être fixé à la surface d'une plaque où il sera à nouveau amplifié puis séquencé. La surface de cette plaque, également appelée cellule d'écoulement, présente une forte densité de brins d'ADN courts fixés à sa surface. Les molécules d'ADN sont capables de se lier à un adaptateur sur la cellule d'écoulement car les séquences sont complémentaires.

LES ÉTAPES DE LA GÉNÉRATION D'AMAS :

Une fois les molécules d'ADN liées à la cellule d'écoulement, deux étapes suivront.

La PCR en pont

La molécule d'ADN liée à la molécule d'ADN courte (représentée par la molécule bleue) se pliera et se liera à l'autre molécule (représentée par la molécule violette), créant un "pont" (voir figure 1). Une polymérase se fixera alors sur la molécule violette et amplifiera l'ADN, créant deux molécules d'ADN complémentaires. Le pont est alors libéré et chacune des molécules d'ADN n'est plus liée qu'à une molécule d'ADN courte. Le processus est répété plusieurs fois, générant un amas dans lequel nous pouvons trouver les deux ADN, les molécules d'ADN qui sont liées à la molécule bleue et la molécule d'ADN fixée à la molécule violette. Environ 4 000 molécules d'ADN se trouvent dans chaque amas après l'amplification PCR en pont, mais la moitié d'entre elles sont éliminées par lavage, ne laissant que 2 000 molécules d'ADN par amas. Cette étape est décrite ci-dessous.

Le lavage

Pour l'instant, nous avons deux brins d'ADN complémentaires qui se fixent à la surface de la cellule d'écoulement. Mais nous ne voulons séquencer que des amas d'ADN identiques, dits "clonaux" (par exemple, seulement l'ADN lié à la molécule bleue). Nous allons éliminer les autres molécules d'ADN liées à la molécule violette. Il ne restera donc plus que des molécules d'ADN qui ont été synthétisées avec la même orientation. Maintenant, chaque amas ne contient que des molécules d'ADN liées à la molécule bleue, et ils sont identiques car ils ont été amplifiés clonalement. À la fin de l'étape de génération d'amas, on peut s'attendre à avoir environ 200 millions d'amas d'ADN amplifiés clonalement dans une cellule d'écoulement. Cela fait beaucoup d'ADN prêt à être séquencé !

Figure 1 : la génération d'amas montre la PCR en pont et l'amplification.