L'isolement de l'ADN
Il est possible d'isoler l'ADN contenu dans les cellules grâce à la méthode d'extraction au phénol-chloroforme. Cette méthode permet d'obtenir un ADN génomique qui contient des millions de gènes. Pour isoler un gène spécifique à partir de l'ADN génomique, on peut appliquer la PCR en utilisant des amorces spécifiques. Si le gène d'intérêt a été fourni dans un vecteur, une enzyme de restriction spécifique peut être utilisée pour l'isolement.
L'extraction au phénol-chloroforme
Les acides nucléiques des cellules peuvent être isolés grâce à la méthode d'extraction au phénol-chloroforme. Le phénol-chloroforme est un mélange de phénol saturé en tampon et de chloroforme dans un rapport de 1:1. La première étape de l'extraction est la lyse des cellules et leur homogénéisation dans une solution aqueuse. Ensuite, le phénol-chloroforme est ajouté au mélange, ce qui permet de créer deux phases qui seront séparées par centrifugation. Le phénol purifié a une densité de 1,07 g/cm3 alors que le chloroforme a une densité plus élevée (1,47 g/cm3). Par conséquent, la centrifugation produit deux phases : la phase organique inférieure et la phase aqueuse supérieure.
Les acides nucléiques acquièrent leur polarité grâce à leur squelette phosphate de charge négative ; ils sont donc solubles dans la phase aqueuse supérieure. Les protéines contiennent des régions hydrophobes qui interagissent avec le phénol et provoquent la précipitation des protéines à l'interface entre les deux phases (souvent sous forme de floculation blanche). Les lipides ont également une région hydrophobe et se dissolvent dans la phase organique inférieure. Le pH du mélange détermine la séparation des acides nucléiques. Lorsque le pH neutre, l'ARN et l'ADN sont retenus dans la phase aqueuse supérieure, mais lorsque le pH acide, l'ADN se déplace vers la phase organique inférieure et l'ARN reste dans la phase aqueuse supérieure. Dans la dernière étape, les acides nucléiques sont récupérés de la phase aqueuse par précipitation à l'aide d'isopropanol.
NanoDrop
Le rendement (ou la concentration) et la pureté de l'ADN peuvent être déterminés en mesurant l'absorbance à l'aide d'un spectrophotomètre. NanoDrop est un spectrophotomètre qui peut mesurer l'absorbance de 0,5 à 2 μl en utilisant le système de rétention d'échantillon. Le système de rétention d'échantillon permet de mesurer des échantillons à forte concentration sans dilution. L'absorbance est mesurée à 260 nm (A260), où l'ADN absorbe le plus fortement la lumière. La quantité de lumière absorbée est proportionnelle à la quantité d'ADN dans l'échantillon.
La relation est décrite par la loi de Beer-Lambert : c = (A * ε)/b
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c : la concentration d'acide nucléique en ng/μL
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A : l'absorbance en UA
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ε : le coefficient d'extinction lié à la longueur d'onde en ng-cm/μL
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b : le trajet optique en cm
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Le coefficient d'extinction de l'ADN double brin est de 50 ng-cm/μL
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Dans ce cas, le trajet optique du NanoDrop est de 10 mm
La pureté de l'ADN peut être évaluée en le mesurant à λ = 280 nm, λ = 230 nm et λ = 320 nm et en calculant le rapport pour 260/280 nm , 260/230 nm et 260/320 nm. Les acides nucléiques absorbent fortement la lumière à 260 nm tandis que les contaminants organiques tels que le phénol et le Trizol absorbent la lumière à 230 nm et les protéines à 280 nm. Ni les acides nucléiques ni les protéines n'absorbent la lumière à 320 nm.
Pour 260/280, un rapport d'environ 1,8 est généralement accepté comme étant de l'ADN pur, tandis que pour l'ARN pur, le rapport est d'environ 2. Pour 260/320, un rapport de 1,8 à 2,2 signifie généralement que l'échantillon d'acide nucléique est accepté comme étant pur. Pour 260/230, un rapport < 1,8 représente une présence significative de contaminants organiques.