Les paramètres d'électroporation

La tension

Les conditions électriques pour l'électroporation de chaque micro-organisme sont variables. Par exemple, une levure telle que Saccharomyces cerevisiae, a une condition électrique optimale de 1,5 kV pendant environ 5ms pour 40 μL de cellules.

Les cellules

Les cellules électro-compétentes sont utilisées pour augmenter l'efficacité de l'électroporation. Les cellules de levure sont rendues électrocompétentes par lavage, avec l'utilisation d'une solution non ionique dans le but d'éliminer tous les sels. Ce processus garantit que la charge n'est pas conduite à travers le milieu. L'électroporation optimale pour la levure est obtenue en utilisant une levure se trouvant en phase logarithmique moyenne ou tardive. La phase logarithmique de la levure peut être divisée en trois parties :

• La phase logarithmique précoce : période pendant laquelle les densités cellulaires sont d'environ 10⁷ cellules/ml.
• La phase logarithmique moyenne : les cultures ont des densités comprises entre 1 et 5 × 10⁷ cellules/ml.
• La phase logarithmique tardive : elle se produit lorsque les densités cellulaires sont comprises entre 5 × 10⁷ et 2 × 10⁸ cellules/ml.

Pendant la phase logarithmique, le taux de croissance est rapide et le taux de division cellulaire dépasse le taux de mort cellulaire. Les cellules sont métaboliquement actives et ont une réplication du génome suffisante pour effectuer une réparation efficace de l'ADN. Les cellules de cette phase peuvent donc tolérer des traitements sévères comme l'électroporation.

L'ADN

La fréquence de transformation est augmentée en augmentant la concentration d'ADN dans le tampon d'électroporation. Cependant, une concentration trop élevée d'ADN peut également diminuer l'efficacité de la transformation. La concentration exacte d'ADN doit être déterminée pour chaque expérience.

Le milieu d'électroporation

Pour éviter la formation d'un arc électrique pendant l'électroporation, il est important de laver soigneusement la cellule électrocompétente afin d'éliminer le milieu de croissance de la cellule. Le lavage peut être effectué avec de l'eau ou avec une solution non ionique telle que le glucose, le glycérol, le saccharose, le sorbitol ou le polyéthylène glycol. La présence d'un matériau ionique peut provoquer un arc électrique pendant l'électroporation.

Le sorbitol est utilisé de préférence parce qu'il agit comme un cryoprotecteur non perméable qui réduit considérablement les dommages causés à la membrane cellulaire pendant la décongélation. Les dommages causés à la membrane réduisent considérablement l'efficacité de la transformation.

Pendant la procédure d'électroporation, la température augmente et les cellules subissent des lésions membranaires causées par un influx et un efflux d'eau rapides dus à un grand déséquilibre osmotique extracellulaire et intracellulaire. Ce type de lésion peut être évité grâce à un stabilisateur osmotique tel que le sorbitol. Ainsi, le sorbitol agit comme un cryoprotecteur et un osmorégulateur.