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L'analyse cinétique des enzymes

La cinétique enzymatique est l’étude des mécanismes enzymatiques grâce à la détermination des vitesses de réaction dans des conditions variées. La vitesse d’une réaction dépend de plusieurs facteurs, dont la concentration du substrat et de l’enzyme, la température, le pH et la présence d’inhibiteurs. [1]

Dans la partie supérieure se trouve une illustration de la courbe de saturation de Michaelis-Menten. L’axe des x représente les concentrations de substrat et l’axe des y la vitesse de réaction. Une courbe de Michaelis-Menten est tracée sur le graphique comme une courbe qui augmente rapidement puis atteint un palier peu après. Les données sont marquées par des puces et une ligne les reliant est tracée en bleu. La représentation graphique illustre le fait que la vitesse de réaction augmente à mesure que la concentration du substrat augmente. L’augmentation de la vitesse de réaction est rapide au début de la réaction, mais au fur et à mesure que la concentration de substrat augmente, la vitesse de la réaction diminue et la courbe atteint un seuil. À ce stade, la réaction se rapproche de sa vitesse maximale, qui est indiquée sur le graphique par V max. Le graphique indique également la valeur ½ • V max, où la réaction atteint 50 % de sa vitesse maximale. Une troisième variable sur le graphique est le k m qui est égal à la concentration de substrat où la vitesse de réaction est ½ • V max. En bas, on trouve une autre illustration d’un graphique où le temps est en abscisse et la formation du produit en ordonnée. La courbe reflète la réaction enzymatique générale, qui est représentée par le changement de la concentration en fonction du temps. Ce changement est le résultat de la formation du produit créé à partir du substrat. À mesure que le temps augmente, le produit augmente également de manière linéaire jusqu’à ce que la courbe commence à atteindre un seuil en raison de la diminution de la vitesse de réaction.

Figure 1 : En haut : la courbe de saturation de Michaelis-Menten. En bas : la courbe de progression d’une réaction enzymatique globale.

La réalisation des analyses cinétiques

Une analyse cinétique vise à modéliser la vitesse de réaction V, en fonction de la concentration du substrat, [S], comme illustré sur la figure 1. Il est donc indispensable de mesurer la vitesse de la réaction pour plusieurs concentrations différentes de substrat. Pour chaque concentration de substrat, on obtient une courbe de progression qui indique la quantité de produit formé en fonction du temps. Cette courbe de progression est illustrée sur la figure 1. Comme indiqué sur la figure, la vitesse de la réaction est plus ou moins constante au début de la réaction ; cependant, lorsque le substrat vient à manquer, la vitesse diminue et la courbe de progression atteint un seuil. Comme [S] change au cours de la réaction, il est fréquent de mesurer les vitesses initiales (V0) des réactions et de les représenter en fonction de la concentration du substrat. V0 est mesurée sous la forme de la pente de la courbe de progression au début de la réaction lorsque la courbe de progression est encore linéaire [1].

Le modèle le plus simple de V en fonction de [S] est l’équation de Michaelis-Menten. Les réactions pour lesquelles on peut appliquer l’équation de Michaelis-Menten, présentent une augmentation de la vitesse de réaction lorsque [S] augmente ; cependant, cette augmentation est réduite lorsque la vitesse se rapproche de la vitesse maximale, Vmax comme le montre la figure 1. L’équation de Michaelis-Menten sera décrite plus en détail dans les pages suivantes [1].

Les facteurs qui influencent la vitesse de réaction

La température et le pH ont également une incidence sur la vitesse de réaction. Les enzymes ont un pH optimal, qui dépend de la composition de l’enzyme. Les propriétés des chaînes latérales des acides aminés de l’enzyme en sont la cause : certaines chaînes latérales doivent être protonées ou déprotonées pour que l’enzyme soit fonctionnelle. La protonation ou la déprotonation d’une chaîne latérale d’acide aminé dépend du pKa de la chaîne latérale et du pH de la solution. Par exemple, l'histidine a un pKa de 6,0, ce qui signifie qu’elle sera principalement protonée à un pH<6,0 et principalement déprotonée à un pH>6,0. Notez que le pKa des chaînes latérales peut être modifiée en fonction de l’environnement. Par conséquent, le pKa des chaînes latérales dans les enzymes n’est habituellement pas le même que celui des acides aminés libres. La température affecte également la vitesse de réaction : une augmentation de la température entraîne une augmentation de la vitesse de réaction ; cependant, à une certaine température, selon l’enzyme, l’enzyme commence à se dénaturer et la vitesse de réaction commence donc à diminuer au-delà de cette température [1].

Le simulateur

Ici, vous vous servirez d’un simulateur pour réaliser les expériences cinétiques. Ce simulateur est conçu sur la base d’un modèle mathématique, et il est de ce fait "parfait", autrement dit, ne présente pas la moindre erreur expérimentale. Ce n’est bien évidemment pas la manière dont le résultat d’une analyse cinétique enzymatique fonctionnerait dans la vraie vie. Dans la réalité, il est impossible d’obtenir des données aussi parfaites.

Les références

  1. Lehninger, Albert L. ; Nelson, David L. ; Cox, Michael M. (2008). Principles of Biochemistry (5th ed). New York, NY : W.H. Freeman and Company. ISBN 978-0-7167-7108-1.