Les microscopes à fluorescence
Un microscope à fluorescence est semblable à un microscope optique. Plutôt que de diffuser la lumière visible dans tout le spectre à travers l'échantillon, le microscope fluorescent ne diffuse qu'une longueur d'onde spécifique sur l'échantillon. Cela peut se faire par l'intermédiaire d'un filtre d'excitation qui ne permet qu'à la lumière d'une longueur d'onde spécifique d'atteindre l'échantillon, ou au moyen de lasers qui n'émettent qu'une longueur d'onde spécifique. Cette longueur d'onde correspond au spectre d'absorption du fluorophore, qui émet alors une longueur d'onde plus grande utilisée pour produire une image. Il est préférable de réaliser l'observation dans l'obscurité pour une meilleure détection des signaux fluorescents et pour éviter de blanchir la lamelle, car les colorants fluorescents sont sensibles à la lumière.
Figure 1 : Vue schématique des principaux composants d'un microscope à fluorescence : source de lumière, filtre d'excitation, miroir dichroïque et filtre d'émission.
Les microscopes à fluorescence sont équipés d'un carrousel de cubes de filtres. Dans ces cubes, on trouve un filtre d'excitation, un miroir dichroïque et un filtre d'émission. Leur association permet de faire correspondre les longueurs d'onde d'excitation et d'émission de certains fluorophores. Par conséquent, les cubes de filtration sont spécifiques à une certaine tache.
Depuis la source de lumière, la lumière atteint un filtre d'excitation qui ne laisse passer que la lumière de la longueur d'onde spécifique qui excite le fluorophore. Ces ondes lumineuses frappent un miroir dichroïque qui réfléchit la lumière de la longueur d'onde d'excitation vers l'échantillon, où elle excite le fluorophore. La lumière émise passe à une longueur d'onde plus grande et est captée par l'objectif. Lorsque la lumière atteint le miroir dichroïque, cette lumière de plus grande longueur d'onde passe à travers le miroir vers les oculaires ou la caméra. La diffusion de la lumière des autres longueurs d'onde est cependant réfléchie par le miroir dichroïque et ne peut pas être détectée par les oculaires ou la caméra. Le filtre d'émission qui se trouve entre le miroir dichroïque et la caméra filtre toutes les autres longueurs d'onde (arrière-plan).