Les spectres de fluorescence
La fluorescence est générée lorsque les électrons du fluorophore, portés à un état d'énergie supérieur, retombent à l'état fondamental (voir figure 1). Les électrons sont amenés à l'état excité s2, par la lumière d'une longueur d'onde spécifique. Les électrons perdent une partie de cette énergie, par exemple par la chaleur, et retombent à l'état excité s1. La fluorescence est émise lorsque les électrons perdent l'énergie restante en retombant de l'état s1 à l'état fondamental. L'énergie plus faible de la lumière émise signifie que cette lumière a une plus grande longueur d'onde.
Figure 1 : L'absorption de lumière d'une longueur d'onde spécifique provoque l'excitation des électrons d'un fluorophore dans l'état excité s2. Les électrons perdent une partie de leur énergie, par exemple par perte de chaleur, et retombent dans un état moins énergétique, mais toujours excité, appelé s1. Lorsque les électrons retombent à l'état fondamental, une fluorescence est émise. L'énergie plus faible de la lumière émise signifie qu'elle a une plus grande longueur d'onde.
Lorsque l'on utilise différents fluorophores dans le même échantillon en microscopie à fluorescence, il est important que les spectres d'émission des deux fluorophores ne se superposent pas de manière significative. Si c'est le cas, il peut être impossible de distinguer le signal des deux molécules l'une de l'autre dans la détection. Ce phénomène est aussi connu sous le nom de "chevauchement".