La technique de clonage Gateway

La technique de clonage Gateway offre une voie rapide et efficace pour le clonage. Cette technologie repose sur l'utilisation de versions modifiées des recombinases du bactériophage lambda. Ce virus insère son génome dans l'ADN de l'hôte en utilisant ces enzymes. Le système de clonage Gateway les utilise pour réaliser une recombinaison spécifique de site à haute efficacité. La deuxième caractéristique utile de ce système est ses sites de reconnaissance pour les enzymes de la clonase appelés sites att et l'utilisation de différents types de vecteurs.

Regardez l'animation ci-dessous pour avoir un aperçu de la réaction Gateway.

Les réactions BP et LR

Les réactions BP et LR sont la façon dont les différents segments d'ADN sont déplacés d'un endroit à l'autre dans les différentes structures. Au cours de la réaction BP, les sites attB et attP sont recombinés. Cette réaction échange l'ADN entre les brins, créant un site attL et un site attR. Au cours de la réaction LR, les sites attL et attR sont recombinés de manière similaire, ce qui donne des sites attB et attP. Il existe un nombre limité de sites att qui sont annotés par des numéros. Cela signifie qu'il existe un nombre limité de combinaisons. Chaque site ne se recombine qu'au sein du groupe : par exemple, les sites attL1 ne se recombinent qu'avec les sites attR1, ce qui donne les sites attB1 et attP1. L'orientation de ces sites est également spécifique, et la construction du gène est hautement prévisible. La construction souhaitée peut être réalisée en sélectionnant les extrémités att appropriées, les réactions et les vecteurs.

Les différents types de vecteurs

Les sites att recyclables conviennent parfaitement à la création de réseaux de vecteurs qui peuvent être utilisés pour combiner efficacement différentes composantes de circuit génétique.

• Les vecteurs d'expression (AmpR) : le clone d'expression est le produit final d'une réaction de passerelle. C'est le plasmide complet, prêt pour la transformation.

• Les vecteurs donneur (ccdB, KanR) : le vecteur donneur fournit le squelette pour la création de clones d'entrée. Les vecteurs donneurs sont généralement désignés par des noms commençant par pDONR. Ces plasmides portent des sites attB ou attP entourant le gène ccdB, ainsi que le gène de résistance à la kanamycine.

• Les vecteurs d'entrée (KanR) : les vecteurs d'entrée sont créés à partir du vecteur donneur et d'une séquence d'ADN flanquée des sites att correspondants. Ces séquences d'intérêt sont généralement produites par PCR, avec des amorces qui contiennent les sites att. Les vecteurs d'entrée contiennent des sites attL ou attR entourant la séquence d'intérêt, ainsi que le gène de résistance à la kanamycine. Les vecteurs d'entrée sont idéalement adaptés à un réseau de pièces de circuit.

• Les vecteurs de destination (ccdB, AmpR) : le vecteur de destination fournit le squelette des clones d'expression. Les vecteurs de destination sont généralement désignés par des noms commençant par pDEST. Ces plasmides contiennent le gène ccdB entouré de sites attL ou attR, ainsi qu'un gène de résistance à l'ampicilline. Les vecteurs de destination contiennent également les origines de réplication pour des hôtes spécifiques et des motifs d'ADN supplémentaires.

La sélection

La sélection des vecteurs d'intérêt dans les différentes étapes de la procédure de clonage Gateway est très importante. Pour la sélection, le système Gateway s'appuie sur deux résistances aux antibiotiques et le gène ccdB pour la sélection positive. La résistance aux antibiotiques permet aux cellules transformées de se développer sur un milieu contenant des antibiotiques qui tuent les cellules non transformées.

Cliquez ici si vous voulez en savoir plus sur la résistance à l'ampicilline.

Le gène ccdB code une bactériotoxine qui empêche la réplication de l'ADN. Tous les squelettes des clones Gateway (pDEST et pDONR) portent ce gène et seules les bactéries portant un gène ccdA supplémentaire se développeront lorsqu'elles seront transformées avec ces plasmides.