Préparation du clonage par assemblage de brins Gibson

Pour le clonage par assemblage de brins Gibson, vous aurez besoin de fragments d'ADN dont les extrémités se chevauchent. Ces fragments sont souvent obtenus grâce à une digestion par enzymes de restriction.

Pour obtenir un rendement élevé avec la méthode de clonage par assemblage de brins Gibson, le même nombre de fragments d'ADN doit être ajouté au mélange réactionnel. Dans la plupart des cas, les fragments ont des longueurs différentes. Vous devez donc calculer la concentration équimolaire avec la formule suivante :

La concentration des différents fragments d'ADN peut être mesurée à l'aide du Nanodrop, qui est un instrument permettant de mesurer les concentrations d'acides nucléiques dans une quantité minimale de liquide. La longueur des fragments peut être déterminée à partir des cartes de plasmide. Une fois que vous avez calculé la quantité nécessaire de chaque fragment, vous devez ajouter de l'eau jusqu'au volume de réaction prédéfini. Pour démarrer la réaction, il suffit d'ajouter le même volume de mélange réactionnel 2x Gibson et d'incuber l'échantillon à 50 degrés Celsius pendant une heure.