La constante Km
La constante de Michaelis, Km, est un paramètre de l’équation de Michaelis-Menten. Km est égale à la concentration de substrat pour laquelle la vitesse de réaction correspondante est ½ • Vmax. Une enzyme avec un Km faible, atteint donc sa vitesse semi-maximale avec une faible concentration de substrat, alors que pour atteindre cette vitesse, une enzyme avec un Km élevé a besoin de concentrations de substrat élevées. Les expériences ont montré que la constante Km d’une enzyme est généralement proche de la concentration cellulaire de son substrat. Pour une réaction enzymatique à 2 étapes, où la seconde étape limite la vitesse, Km est approximativement égal à la constante de dissociation du complexe ES. Dans ce cas, une valeur faible de Km indique une forte affinité pour le substrat ; toutefois, cette interprétation de Km n’est valable que pour quelques enzymes [1].
Figure 1 : Figure 1.a ; l’équation de Michaelis-Menten appliquée à une représentation graphique des vitesses initiales en fonction de la concentration du substrat. Lorsque la concentration du substrat est égale à Km, la vitesse de réaction est ½*Vmax. Figure 1.b ; l’illustration de l’équation de Lineweaver-Burk appliquée à une transformation double-réciproque d’un ensemble de données cinétiques enzymatiques.
L’équation de Lineweaver-Burk
Il existe plusieurs méthodes pour déterminer la valeur de Km. La méthode la plus directe consiste à représenter V0 en fonction de [S] et à se servir d’un logiciel d’ajustement de courbe pour obtenir directement l’équation de Michaelis-Menten. Toutefois, certaines transformations permettent de déterminer la valeur de Km par régression linéaire et ces transformations sont également utiles pour analyser l’inhibition enzymatique. Il y a plusieurs transformations possibles ; une simple est cependant obtenue en prenant la réciproque des deux côtés de l’équation de Michaelis-Menten. Cela conduit à la formule suivante, appelée équation de Lineweaver-Burk :
1/V0 = 1/Vmax + Km/Vmax - 1/[S]
Cette équation montre que la représentation graphique de 1/V0 en fonction de 1/[S] doit donner une courbe qui peut être ajustée par une ligne droite avec l’ordonnée à l'origine 1/Vmax et la pente Km/Vmax. Ainsi, on peut obtenir la valeur de K m par régression linéaire. La figure 1.b illustre comment interpréter la pente et les intersections d’un diagramme de Lineweaver-Burk. [1]
Autres transformations
Il faut noter que le diagramme de Lineweaver-Burk n’est pas la seule option. Une représentation de [S]/V0 en fonction de [S] (une représentation de Hanes-Woolf) donnera également une ligne droite [2]. En revanche, dans ce cas, nous nous servirons de la transformation de Lineweaver-Burk.
Les références
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Lehninger, Albert L. ; Nelson, David L. ; Cox, Michael M. (2008). Principles of Biochemistry (5th ed.). New York, NY : W.H. Freeman and Company. ISBN 978-0-7167-7108-1.
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Atkins, G.L. et Nimmo, I.A. (1975) A comparison of seven methods for fitting the Michaelis-Menten equation. Biochem. J. 149, 775-777.